Un método de PCR cuantitativa en tiempo real específico para la detección y cuantificación de la primera planta comercializada con genoma editado

Título original: A Real-Time Quantitative PCR Method Specific for Detection and Quantification of the First Commercialized Genome-Edited Plant

Autores: Pradheep Chhalliyil, Heini Ilves, Sergei A. Kazakov, Stephanie J. Howard, Brian H. Johnston y John Fagan

Revista: Foods

Año: 2020

Palabras clave: Detección, qPCR, edición genética, OGM

Resumen

La discusión sobre el estado regulatorio de los cultivos modificados por edición genética se ha centrado en la precisión de la edición y en las dudas sobre la viabilidad de un monitoreo analítico que cumpla con las regulaciones de OGM existentes. Los métodos de detección eficaces son importantes, tanto para la aplicación de la normativa como para la trazabilidad en caso de impactos ambientales, socioeconómicos o de bioseguridad. Aquí, abordamos por primera vez la pregunta de investigación en el laboratorio e informamos el desarrollo exitoso de un método de detección cuantitativa por PCR para el primer cultivo comercializado modificados por edición genómica, una variedad de canola con una edición de un solo par de bases que confiere tolerancia a herbicidas. El método es altamente sensible y específico (límite de cuantificación, 0.05%), compatible con los estándares de práctica, equipo y experiencia típicos de los laboratorios de OGM, y fácilmente integrable en sus flujos de trabajo analíticos, incluido el uso del enfoque matricial. El método, validado por un laboratorio independiente, cumple con todos los requisitos legales para los métodos analíticos de OMG en jurisdicciones como la UE, es consistente con los estándares de acreditación ISO17025 y se ha colocado en el dominio público. Habiendo desarrollado un método qPCR para la clase más desafiante de ediciones del genoma, variantes de un solo nucleótido, esta investigación sugiere que el desarrollo de métodos basados ​​en qPCR puede ser aplicable a prácticamente cualquier organismo editado genómicamente. Este avance resuelve dudas sobre la viabilidad de extender el enfoque regulatorio que se emplea actualmente para los OGM basados ​​en ADN recombinante a organismos con genoma editado.

Abstract

Discussion regarding the regulatory status of genome-edited crops has focused on precisión of editing and on doubts regarding the feasibility of analytical monitoring compliant with existing GMO regulations. Effective detection methods are important, both for regulatory enforcement and traceability in case of biosafety, environmental or socio-economic impacts. Here, we approach the analysis question for the first time in the laboratory and report the successful development of a quantitative PCR detection method for the first commercialized genome-edited crop, a canola with a single base pair edit conferring herbicide tolerance. The method is highly sensitive and specific (quantification limit, 0.05%), compatible with the standards of practice, equipment and expertise typical in GMO laboratories, and readily integrable into their analytical workflows, including use of the matrix approach. The method, validated by an independent laboratory, meets all legal requirements for GMO analytical methods in jurisdictions such as the EU, is consistent with ISO17025 accreditation standards and has been placed in the public domain. Having developed a qPCR method for the most challenging class of genome edits, single-nucleotide variants, this research suggests that qPCR-based method development may be applicable to virtually any genoma edited organism. This advance resolves doubts regarding the feasibility of extending the regulatory approach currently employed for recombinant DNA-based GMOs to genome-edited organisms.

  

Detección e Identificación de plantas editadas genómicamente. Retos y oportunidades.

Título original: Detection and Identification of Genome Editing in Plants:

Autores: Lutz Grohmann, Jens Keilwagen, Nina Duensing, Emilie Dagand, Frank Hartung, Ralf Wilhelm, Joachim Bendiek y Thorben Sprink

Revista: Frontiers in Plant Science

Año: 2019

Resumen

Las técnicas de ingeniería genética convencionales generan modificaciones en el genoma a través de la integración estable de elementos de ADN que no ocurren naturalmente bajo esa combinación. Por lo tanto, los organismos resultantes y (la mayoría) de los productos de los mismos pueden inequívocamente identificarse con métodos basados ​​en PCR específicos para eventos dirigidos al sitio de inserción. Las nuevas técnicas de generación, como la edición del genoma, diversifican la caja de herramientas para generar variabilidad en plantas. Varias de estas técnicas pueden introducir cambios de un solo nucleótido. sin integrar ADN extraño y, por lo tanto, generar organismos con los fenotipos deseados. En consecuencia, tales organismos y productos de los mismos pueden ser indistinguibles de los contrapartes existentes o criadas convencionalmente con herramientas analíticas establecidas. Las modificaciones pueden parecerse por completo a mutaciones aleatorias independientemente de que sean espontáneas o inducida químicamente o por irradiación. Por lo tanto, si una identificación de estos organismos o productos de los mismos, surgirá un nuevo desafío para las semillas, alimentos y piensos laboratorios de pruebas e instituciones de aplicación. Para una consideración detallada, distinguimos entre la detección de alteraciones de secuencia, independientemente de su origen, la identificación del proceso que generó una modificación específica y la identificación de un genotipo, es decir, un organismo producido por la edición del genoma que lleva una alteración genética específica en un ambiente conocido. Este artículo revisa brevemente la detección actual y futura y las estrategias de identificación (incluido el uso de enfoques bioinformáticos y estadísticos) en particular para plantas desarrolladas con técnicas de edición del genoma

Abstract

Conventional genetic engineering techniques generate modifications in the genome via stable integration of DNA elements which do not occur naturally in this combination. Therefore, the resulting organisms and (most) products thereof can unambiguously be identified with event-specific PCR-based methods targeting the insertion site. New breeding techniques such as genome editing diversify the toolbox to generate genetic variability in plants. Several of these techniques can introduce single nucleotide changes without integrating foreign DNA and thereby generate organisms with intended phenotypes. Consequently, such organisms and products thereof might be indistinguishable from naturally occurring or conventionally bred counterparts with established analytical tools. The modifications can entirely resemble random mutations regardless of being spontaneous or induced chemically or via irradiation. Therefore, if an identification of these organisms or products thereof is demanded, a new challenge will arise for (official) seed, food, and feed testing laboratories and enforcement institutions. For detailed consideration, we distinguish between the detection of sequence alterations – regardless of their origin – the identification of the process that generated a specific modification and the identification of a genotype, i.e., an organism produced by genome editing carrying a specific genetic alteration in a known background. This article briefly reviews the existing and upcoming detection and identification strategies (including the use of bioinformatics and statistical approaches) in particular for plants developed with genome editing techniques.

Reordenamientos genómicos inesperados en loci específicos asociados con el knock-in mediado por CRISPR/Cas9

Título original: Challenges and Opportunities

Autores: Amélie Rezza; Christelle Jacquet; Amélie Le Pillouer; Florian Lafarguette; Charlotte Ruptier; Marion Billandon; Patricia Isnard Petit; Séverine Trouttet; Kader Thiam; Alexandre Fraichard; Yacine Chérifi

Revista: Scientific Reports

Año: 2019

Palabras clave: Genoma; Impulsores genéticos; Gene drives; CRISPR-Cas9; OGM

Resumen

La herramienta de edición genómica CRISPR-Cas9 permite modificaciones accesibles y eficientes que reactivaron la investigación molecular en ciertas especies. Sin embargo, la integración de fragmentos de ADN largos usando CRISPR-Cas9 aún es desafiante en numerosos modelos de investigación. Para comparar sistemáticamente la eficiencia de CRISPR-Cas9 respecto de la recombinación homóloga clásica (cHR) para la inserción de fragmentos de ADN largos, realizamos y analizamos 221 experimentos dirigidos hacia 128 loci en células ES de ratón. Aunque ambas tecnologías mostraron ser eficientes, CRISPR-Cas9 produjo significativamente más clones positivos, detectados por PCR de superposición. También produjo reordenamientos inesperados alrededor del sitio blanco, siendo el sistema CRISPR-Cas9 en última instancia menos eficiente que la cHR para la producción de clones completamente validados. Los datos muestras que la recombinación mediada por CRISPR-Cas9 puede inducir modificaciones complejas de largo alcance en el loci blanco, lo cual enfatiza la necesidad de una caracterización detallada de cualquier material modificado mediante la edición genómica por CRISPR-Cas9, antes de cualquier estudio funcional o uso terapéutico.

Abstract

The CRISPR/Cas9 gene editing tool enables accessible and efficient modifications which (re)ignited molecular research in certain species. However, targeted integration of large DNA fragments using CRISPR/Cas9 can still be challenging in numerous models. To systematically compare CRISPR/Cas9 s efficiency to classical homologous recombination (cHR) for insertion of large DNA fragments, we thoroughly performed and analyzed 221 experiments targeting 128 loci in mouse ES cells. Although both technologies proved efficient, CRISPR/Cas9 yielded significantly more positive clones as detected by overlapping PCRs. It also induced unexpected rearrangements around the targeted site, ultimately rendering CRISPR/Cas9 less efficient than cHR for the production of fully validated clones. These data show that CRISPR/Cas9-mediated recombination can induce complex long-range modifications at targeted loci, thus emphasizing the need for thorough characterization of any genetically modified material obtained through CRISPR-mediated gene editing before further functional studies or therapeutic use.

  

Los editores de bases de citosina, pero no de adenina, inducen mutaciones fuera del objetivo en todo el genoma del arroz

Título original: Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.

Autores: Shuai Jin; Yuan Zong; Qiang Gao; Zixu Zhu; Yanpeng Wang; Peng Qin; Chengzhi Liang; Daowen Wang; Jin-Long Qiu; Feng Zhang; Caixia Gao

Revista: Science

Año: 2019

Palabras clave: CBE; ABE; guía única de ARN; CRISPR; secuenciación completa de genoma; SNV

Resumen

Los Editores base de citosina y adenina (CBE y ABE), son herramientas nuevas y prometedoras para lograr los cambios genéticos precisos requeridos para el tratamiento de enfermedades y mejora de rasgos. Sin embargo, todavía hace falta un estudio de asociación de genoma y un análisis imparcial de sus efectos fuera del objetivo in vivo. Nuestro análisis de la secuenciación del genoma completo (WGS) de las plantas de arroz tratadas con BE3, BE3 de alta fidelidad (HF1-BE3), o ABE reveló que BE3 y HF1-BE3, pero no ABE, inducen mutaciones sustanciales en todo el genoma, el cual en su mayoría son del tipo CàT de variantes de un solo nucleótido (SNV) y parecen estar enriquecidas en ciertas regiones genéticas. Notablemente, el tratamiento del arroz con BE3 o HF1-BE3 en ausencia de ARN de guía única también resulta en el aumento de estas mutaciones de un solo nucleótido en todo el genoma. Por lo tanto, la unidad de edición base de BE3 o HF1-BE3 debe ser optimizada con el fin de alcanzar una fidelidad alta.

Abstract

Cytosine and adenine base editors (CBEs and ABEs) are promising new tools for achieving the precise genetic changes required for disease treatment and trait improvement. However, genome-wide and unbiased analyses of their off-target effects in vivo are still lacking. Our whole genome sequencing (WGS) analysis of rice plants treated with BE3, high-fidelity BE3 (HF1-BE3), or ABE revealed that BE3 and HF1-BE3, but not ABE, induce substantial genome-wide off-target mutations, which are mostly the C?T type of single nucleotide variants (SNVs) and appear to be enriched in genic regions. Notably, treatment of rice with BE3 or HF1-BE3 in the absence of single-guide RNA also results in the rise of genome-wide SNVs. Thus, the base editing unit of BE3 or HF1-BE3 needs to be optimized in order to attain high fidelity.

El editor de base de citosina genera variantes sustanciales de un solo nucleótido fuera del objetivo en embriones de ratón

Título original: Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos

Autores: Erwei Zuo; Yidi Sun; Wu Wei; Yuan Tanglong; Wenqin Ying; Hao Sun; Liyun Yuan; Lars M. Steinmetz; Yixue Li; Hui Yang

Revista: Science

Año: 2019

Palabras clave: polimorfismos de un solo nucleótido (SNV); mutaciones patogénicas; CRISPR; Cas9; blastómero; GOTI método

Resumen

La edición del genoma es prometedora para corregir mutaciones patogénicas. Sin embargo, es difícil determinar los efectos fuera del objetivo de la edición debido a polimorfismo de un solo nucleótido en individuos. Desarrollamos un método llamado GOTI (análisis del genoma fuera del objetivo mediante inyección de embriones de dos células) para detectar mutaciones fuera del objetivo mediante la edición de un blastómero de embriones de ratón de dos células que utilizan CRISPR-Cas9 o editores de base. La comparación de las secuencias genómicas completas de las células de la progenie de blastómeros editados y no editados en E14.5 mostró que las variantes de nucleótidos únicos (SNV) fuera del objetivo eran raras en los embriones editados por CRISPR-Cas9 o editor de bases de adenina, con un cierre de frecuencia A la tasa de mutación espontánea. En contraste, la edición de la base de citosina indujo SNV con frecuencias 20 veces más altas, lo que requiere una solución para abordar su fidelidad.

Abstract

Genome editing holds promise for correcting pathogenic mutations. However, it is difficult to determine off-target effects of editing due to single nucleotide polymorphism in individuals. Here, we developed a method named GOTI (Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection) to detect off-target mutations by editing one blastomere of two-cell mouse embryos using either CRISPR-Cas9 or base editors. Comparison of the whole genome sequences of progeny cells of edited vs. non-edited blastomeres at E14.5 showed that off-target single nucleotide variants (SNVs) were rare in embryos edited by CRISPR-Cas9 or adenine base editor, with a frequency close to the spontaneous mutation rate. In contrast, cytosine base editing induced SNVs with over 20-fold higher frequencies, requiring a solution to address its fidelity.

  

Edición libre del genoma: pasado, presente y futuro

Título original: DNA-Free Genome Editing: Past, Present and Future

Autores: Janina Metje-Sprink; Jochen Menz; Dominik Modrzejewski and Thorben Sprink

Revista: Frontiers in plant science

Año: 2019

Palabras clave: Libre de ADN; Edición del genoma; RGEN; CRISPR / Cas; CRISPR / Cpf; planta; TALEN; RNPs

Resumen

La edición del genoma utilizando sistemas de endonucleasas diseñados (GEEN) se apoderó rápidamente del campo de la ciencia de plantas y fitomejoramiento. Hasta ahora, las técnicas de edición del genoma se han aplicado en más de cincuenta plantas diferentes, incluyendo especies modelo como Arabidopsis, los principales cultivos como el arroz, el maíz o el trigo, así como los cultivos económicamente menos importantes como la fresa, el maní y el pepino. Estas técnicas se han utilizado para la investigación básica como prueba de concepto o para investigar las funciones de los genes en la mayoría de sus aplicaciones. Sin embargo, se han atendido varios rasgos orientados al mercado, que incluyen características agronómicas mejoradas, mejor calidad de alimentos y piensos, mayor tolerancia al estrés abiótico y biótico y tolerancia a herbicidas. Estas tecnologías están evolucionando a un ritmo vertiginoso y, especialmente, el campo de la edición del genoma basado en CRISPR avanza increíblemente rápido. Los sistemas CRISPR derivados de una multitud de especies bacterianas se están utilizando para la edición de genes dirigida y ya se han aplicado muchas modificaciones a los sistemas CRISPR existentes, tales como (i) alterar su motivo adyacente de protoespaciador (ii) aumentar su especificidad (iii) alterar su habilidad para cortar ADN y (iv) fusionarlos con proteínas adicionales. Además, el sistema de transformación clásico que utiliza Agrobacteria tumefaciens o Rhizobium rhizogenes, y otras tecnologías de transformación ya están disponibles y hay otros métodos en camino hacia el sector de la plantas. Algunos de ellos están utilizando únicamente prooteinas o complejos de proteína-ARN para la transformación, haciendo posible alterar el genoma sin el uso de ADN recombinante. Debido a esto, es imposible que el ADN extraño se incorpore en el genoma del huésped. En esta revisión, presentaremos los desarrollos y técnicas recientes en el campo de la edición del genoma libre de ADN, sus ventajas y dificultades, y ofreceremos una perspectiva sobre las tecnologías que podrían estar disponibles en el futuro para la edición del genoma en plantas. Además, analizaremos estas técnicas a la luz de las regulaciones existentes y futuras potenciales.

Abstract

Genome Editing using engineered endonuclease (GEEN) systems rapidly took over the field of plant science and plant breeding. So far, Genome Editing techniques have been applied in more than fifty different plants, including model species like Arabidopsis, main crops like rice, maize or wheat as well as economically less important crops like strawberry, peanut and cucumber. These techniques have been used for basic research as proof-of-concept or to investigate gene functions in most of its applications. However, several market-oriented traits have been addressed including enhanced agronomic characteristics, improved food and feed quality, increased tolerance to abiotic and biotic stress and herbicide tolerance. These technologies are evolving at a tearing pace and especially the field of CRISPR based Genome Editing is advancing incredibly fast. CRISPR-Systems derived from a multitude of bacterial species are being used for targeted Gene Editing and many modifications have already been applied to the existing CRISPR-Systems such as (i) alter their protospacer adjacent motif (ii) increase their specificity (iii) alter their ability to cut DNA and (iv) fuse them with additional proteins. Besides, the classical transformation system using Agrobacteria tumefaciens or Rhizobium rhizogenes, other transformation technologies have become available and additional methods are on its way to the plant sector. Some of them are utilizing solely proteins or protein-RNA complexes for transformation, making it possible to alter the genome without the use of recombinant DNA. Due to this, it is impossible that foreign DNA is being incorporated into the host genome. In this review we will present the recent developments and techniques in the field of DNA-free Genome Editing, its advantages and pitfalls and give a perspective on technologies which might be available in the future for targeted Genome Editing in plants. Furthermore, we will discuss these techniques in the light of existing  and potential future regulations.

Detectando e identificando resultados ecológicos adversos relacionados con la liberación de organismos modificados mediante impulsores genéticos (gene-drives)

Título original: Identifying and detecting potentially adverse ecological outcomes associated with the release of gene-drive modified organisms

Autores: Hayes KR; Hosack GR; Dana GV; Foster SD; Ford JH; Thresher R; Ickowicz A; Peel D; Tizard M; De Barro P; Strive T; Dambacher JM

Revista: J of Responsible Innovation

Año: 2018

Palabras clave: Impulsores genéticos; Gene drivers; CRISPR-Cas9; análisis de riesgo; monitoreo; OGM

Resumen

Los impulsores genéticos sintéticos proveen soluciones novedosas a una variedad de problemas antiguos tales como el controlar enfermedades transmitidas por vectores, pestes agrícolas y especies invasoras. En este artículo, mencionamos métodos para identificar peligros y detectar potenciales efectos ecológicos adversos a nivel individual (genotipo, fenotipo), de población, de comunidad y de ecosistema, en las etapas hacia el análisis y liberación de Organismos Modificados mediante Impulsores Genéticos. También discutimos las fortalezas y debilidades de las listas de verificación y de las técnicas estructurales de análisis de riesgos, identificamos métodos que ayuden a identificar los retos existentes en la identificación de efectos ecológicos adversos en experimentos y en pruebas de campo confinadas, y discutimos maneras de mejorar la eficiencia y el rigor estadístico en las estrategias de monitoreo post liberación.

Abstract

Synthetic gene drives could provide new solutions to a range of old problems such as controlling vector-borne diseases, agricultural pests and invasive species. In this paper, we outline methods to identify hazards and detect potentially adverse ecological outcomes at the individual (genotype, phenotype), population, community and ecosystem level, when progressing Gene Drive Modified Organisms through a phased test and release pathway. We discuss the strengths and weaknesses of checklists and structured hazard analysis techniques, identify methods to help meet some of the challenges of detecting adverse ecological outcomes in experiments and confined field trials, and discuss ways to improve the efficiency and statistical rigour of post-release monitoring strategies.

  

La proteína p53 inhibe la ingeniería CRISPR-Cas9 en células troncales humanas

Título original: p53 inhibits CRISPR Cas9 engineering in human pluripotent stem cells

Autores: Ihry RJ; Worringer KA; Salick MR; Frias E; Ho D; Theriault K; et al.

Revista: Nature medicine

Año: 2018

Palabras clave: p53; CRISPR; Cas9; RNPs; células madre; inserciones; deleciones; P5314; rotura de doble cadena

Resumen

CRISPR/Cas9 ha revolucionado nuestra habilidad para diseñar genomas y conducir asociaciones de genomas completos en células humanas. Mientras que algunos tipos de células son susceptibles a la ingeniería genómica, los genomas de células troncales pluripotentes humanas (hPSCs) han sido difíciles de diseñar, con eficiencias reducidas en relación a líneas celulares tumorales o células troncales embrionarias de ratón. Aquí, utilizando líneas celulares troncales pluripotentes humanas con integración estable de Cas9 o administración transitoria de ribonucleoprooteínas-Cas9 (RNPs), logramos una inserción promedio o una eficiencia de eliminación (indel) superior al 80%. Esta alta eficiencia de inserciones y deleciones reveló que las roturas de doble cadena (DSB) inducidas por Cas9 son tóxicas y matan a la mayoría de las células troncales humanas pluripotentes. En estudios previos, la toxicidad de Cas9 en las células troncales humanas fue menos evidente debido a la baja eficiencia de transfección y, posteriormente a la baja inducción de roturas de doble cadena. La respuesta tóxica a estas últimas, fue dependiente de p53/TP53, de modo que la eficiencia de la modificación precisa del genoma en células troncales humanas con un gen de p53 de tipo silvestre se redujo considerablemente. Nuestros resultados indican que la toxicidad de Cas9 crea un obstáculo para el uso de alto rendimiento de CRISPR/Cas9 para la modificación del genoma y la detección en células troncales humanas. Además, como las células troncales pueden adquirir mutaciones de P5314, las terapias de reemplazo de células que utilizan células troncales con tecnología CRISPR/Cas9 deben proceder con precaución, y dichas células diseñadas deben ser monitoreadas para la función de p53.

Abstract

CRISPR/Cas9 has revolutionized our ability to engineer genomes and conduct genome-wide screens in human cells1,2,3. Whereas some cell types are amenable to genome engineering, genomes of human pluripotent stem cells (hPSCs) have been difficult to engineer, with reduced efficiencies relative to tumour cell lines or mouse embryonic stem cells3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Here, using hPSC lines with stable integration of Cas9 or transient delivery of Cas9-ribonucleoproteins (RNPs), we achieved an average insertion or deletion (indel) efficiency greater than 80%. This high efficiency of indel generation revealed that double-strand breaks (DSBs) induced by Cas9 are toxic and kill most hPSCs. In previous studies, the toxicity of Cas9 in hPSCs was less apparent because of low transfection efficiency and subsequently low DSB induction3. The toxic response to DSBs was P53/TP53-dependent, such that the efficiency of precise genome engineering in hPSCs with a wild-type P53 gene was severely reduced. Our results indicate that Cas9 toxicity creates an obstacle to the high-throughput use of CRISPR/Cas9 for genome engineering and screening in hPSCs. Moreover, as hPSCs can acquire P53 mutations14, cell replacement therapies using CRISPR/Cas9-enginereed hPSCs should proceed with caution, and such engineered hPSCs should be monitored for P53 function.

La reparación de roturas de doble cadena inducida por CRISPR-Cas9 conduce a grandes deleciones y reordenamientos complejos

Título original: Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements

Autores: Kosicki M; Tomberg K; Bradley A

Revista: Nat Biotechnology

Año: 2018

Palabras clave: mutagenesis; deleciones; inserciones; CRISPR; Cas9; PCR; secuencia de proximidad inmediata

Resumen

CRISPR/Cas9 está preparado para convertirse en la herramienta de edición genética elegida en contextos clínicos. Hasta hora, la exploración de las alteraciones genéticas inducidas con Cas9 se ha limitad a la proximidad inmediata del sitio diana y las secuencias distales fuera del objetivo, lo que lleva a la conclusión de que CRISPR/Cas9 fue razonablemente específico. Reportamos una significativa mutagenesis en el objetivo como grandes deleciones y reordenamientos genómicos más complejos en los sitios objetivo en células troncales embrionarias de ratón, progenitores hematopoyéticos de ratón y una línea celular humana diferenciada. Usando tecnología de secuencia de lectura larga y el genotipado por PCR de largo alcance, mostramos que las roturas de ADN introducidas por la guía única de ARN/Cas9 se resuelven con frecuencia en deleciones que se extienden a lo largo de muchas kilobases. Además, se identificaron lesiones distales al sitio de corte y eventos de cruce. El daño genómico observado en las células mitóticamente activas ocasionadas por la edición CRISPR/Cas9 puede tener consecuencias patógenas.

Abstract

CRISPR/Cas9 is poised to become the gene editing tool of choice in clinical contexts. Thus far, exploration of Cas9-induced genetic alterations has been limited to the immediate vicinity of the target site and distal off-target sequences, leading to the conclusion that CRISPR/Cas9 was reasonably specific. Here we report significant on-target mutagenesis such as large deletions and more complex genomic rearrangements at the targeted sites in mouse embryonic stem cells, mouse hematopoietic progenitors and a human differentiated cell line. Using long-read sequencing and long-range PCR genotyping, we show that DNA breaks introduced by single-guide RNA/Cas9 frequently resolved into deletions extending over many kilobases. Furthermore, lesions distal to the cut site and cross-over events were identified. The observed genomic damage in mitotically active cells caused by CRISPR/Cas9 editing may have pathogenic consequences.

  

Impulsor genético sintético: entre la continuidad y la novedad

Título original: Synthetic gene drive: between continuity and novelty

Autores: Samson Simon; Mathias Otto & Margret Engelhard

Revista: Science and society

Año: 2018

Palabras clave: Impulsores genéticos; CRISPR; CDB; GDO; OGM; AHTEG; biología sintética

Resumen

CRISPR/Cas9 acelera el desarrollo de impulsores genéticos sintéticos para propagarse rápidamente para la modificación genética entre especies objetivo. Tanto en la Academia como en la Política, el uso de los impulsores genéticos por CRISPR/Cas9 para controlar potencialmente vectores de enfermedades, plagas de plantas o especies exóticas invasoras es controvertido, como lo ejemplificó la última Conferencia de las Partes de la Convención de las Naciones Unidas sobre la Biodiversidad (CDB) y la reunión más reciente de su grupo de expertos científicos en biología sintética (Grupo de expertos técnicos ad hoc / AHTEG). Mientras que algunos argumentan que los marcos actuales de evaluación de riesgos pueden acomodar a los impulsores genéticos sintéticos, otros piden una moratoria debido al impacto potencialmente perjudicial de las unidades genéticas en la vida silvestre. En esencia, la pregunta es si tenemos suficiente experiencia y conocimiento para manejar esta tecnología de manera segura. La experiencia y el conocimiento, a su vez, dependen del grado de continuidad y la novedad de los organismos de transmisión génica sintéticos (GDO), en comparación con los organismos modificados genéticamente existentes (OGM). Si bien los impulsores genéticos existen en la naturaleza, encontramos que los GDO difieren de los OGM actualmente liberados en cinco niveles. Una comprensión y análisis claros de estas diferencias es crucial para cualquier evaluación de riesgos y una evaluación ética y socialmente aceptable que es vital para la aplicación de esta tecnología.

Abstract

CRISPR/Cas accelerates the development of synthetic gene drive organisms to quickly spread a genetic modification among the target species. Both in academia and politics, the use of CRISPR/Cas gene drive to potentially control disease vectors, plant pests or invasive alien species is controversial, as exemplified by the last Conference of the Parties of the United Nations Convention on Biodiversity (CBD) and the most recent meeting of its scientific expert group on synthetic biology (Ad Hoc Technical Expert Group/AHTEG). While some argue that current risk assessment frameworks can accommodate synthetic gene drives, others call for a moratorium owing to gene drives  potentially detrimental impact on wildlife. In essence, the question is whether we have sufficient experience and knowledge to handle this technology safely. Experience and knowledge in turn depend on the degree of continuity and novelty of synthetic gene drive organisms (GDO), compared to existing genetically modified organisms (GMO). While gene drives exist in nature, we find that GDO differ from the currently released GMO on five levels. A clear understanding and analysis of these differences is crucial for any risk assessment regime and a socially acceptable and ethical evaluation that is vital for the application of this technology.

Control de plagas agrícolas con Impulsores genéticos (gene-drives) basados en CRISPR: Momento para el debate público. ¿Deberíamos usar impulsores genéticos para el control de plagas?

Título original: Agricultural pest control with CRISPR?based gene drive: time for public debate Should we use gene drive for pest control?

Autores: Courtier-Orgogozo V; Morizot B; Boëte C

Revista: EMBO Rep

Año: 2017

Palabras clave: Impulsores genéticos; Gene drives; CRISPR-Cas9; análisis de riesgo; monitoreo; OGM; control de plagas; normatividad

Resumen

Los impulsores genéticos basados en el sistema de edición genómica vía CRISPR-Cas9 son una tecnología poderosa que promueve la herencia de la herramienta de impulso genético  a través de reproducción sexual y puede por lo tanto dispersarse rápidamente a través de una población. Posee un gran potencial para propósitos humanitarios y de salud pública, tales como reducir la cantidad de enfermedades transmitidas por vectores como la malaria. Aquí discutimos otra aplicación potencial de los impulsores genéticos basados en CRISPR, es decir, el control de plagas para incrementar la producción de cultivos. Argumentamos que el control de plagas basado en impulsores genéticos debería recibir más atención de los tomadores de decisiones y del público debido a su enorme impacto potencial en el ambiente, su fácil accesibilidad, y la actual escasez de reglamentación.

Abstract

Gene drive based on the CRISPR/Cas?9 gene editing system is a powerful technology that promotes the inheritance of the gene drive tool itself via sexual reproduction and can therefore spread quickly through a population. It holds great potential for public health and humanitarian purposes, such as reducing the burden of vector?borne diseases like malaria. Here, we discuss another potential application of CRISPR?based gene drive, namely the control of pest species to increase crop production. We argue that gene drive?based pest control strategies should receive more attention from policymakers and the public given their enormous potential impact on the environment, their easy accessibility, and the current dearth of regulations.

  

Los cambios en el marco de lectura introducidos por inserciones o deleciones a través de edición genómica pueden conducir a omisiones de exones

Título original: Frameshift indels introduced by genome editing can lead to in-frame exon skipping

Autores: Simon Lalonde; Oliver A. Stone; Samuel Lessard; Adam Lavertu; Jessica Desjardins; Mélissa Beaudoin; Manuel Rivas; Didier Y. R. Stainier; Guillaume Lettre

Revista: PLos one

Año:

Palabras clave: corte y empalme; Marco de lectura; inserciones; deleciones; edición genómica; CRISPR; múltiplos de tres nucleótidos; mutación sin sentido; LGALS8; rs2273865

Resumen

Los cambios en el marco de lectura introducidos por inserciones o deleciones a través de edición genómica se han convertido en una poderosa técnica para estudiar las funciones de genes no caracterizados en líneas celulares y organismos modelo. Dichas mutaciones deberían conducir a la degradación de ARNm debido a la descomposición del ARNm mediada por mutación terminadora o a la producción de proteínas severamente truncadas. Aquí también mostramos que los desplazamientos en el marco de lectura hechos por edición genómica también pueden llevar a la omisión de exones múltiplos de tres nucleótidos . Tales eventos del proceso de corte y empalme resultan en un ARNm en el marco de lectura que podría codificar proteínas total o parcialmente disfuncionales. También caracterizaos una variante de mutación sin sentido (rs2273865) localizada en un exón múltiplo de tres nucleótidos  de LGALS8, el cual aumenta la omisión de exones en muestras de eritoblastos humanos. Nuestros resultados demuestran la contribución potencialmente frecuente de los elementos reguladores del proceso de corte y empalme y son importantes para la interpretación de resultados negativos en experimentos de edición de genomas. Además, Pueden contribuir a una mejor anotación de mutaciones de pérdida de función en el genoma humano.

Abstract

The introduction of frameshift indels by genome editing has emerged as a powerful technique to study the functions of uncharacterized genes in cell lines and model organisms. Such mutations should lead to mRNA degradation owing to nonsense-mediated mRNA decay or the production of severely truncated proteins. Here, we show that frameshift indels engineered by genome editing can also lead to skipping of multiple of three nucleotides  exons. Such splicing events result in in-frame mRNA that may encode fully or partially functional proteins. We also characterize a segregating nonsense variant (rs2273865) located in a multiple of three nucleotides  exon of LGALS8 that increases exon skipping in human erythroblast samples. Our results highlight the potentially frequent contribution of exonic splicing regulatory elements and are important for the interpretation of negative results in genome editing experiments. Moreover, they may contribute to a better annotation of loss-of-function mutations in the human genome.

La edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 induce la omisión de exón por medio de un proceso de corte y empalme alternativo o deleción de exón

Título original: CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by alternative splicing or exon deletion

Autores: Haiwei Mou; Jordan L. Smith; Lingtao Peng; Hao Yin; Jill Moore; Xiao-Ou Zhang; Chun-Qing Song; Ankur Sheel; Qiongqiong Wu; Deniz M. Ozata; Yingxiang Li; Daniel G. Anderson; Charles P. Emerson; Erik J. Sontheimer; Melissa J. Moore; Zhiping Weng and Wen Xue

Revista: Genome Biology

Año: 2017

Palabras clave: CRISPR; Cas9; inserciones; deleciones; exón; intron; guía única de ARN; ?-catenina

Resumen

La Técnica CRISPR se usa ampliamente para interrumpir la función del gen al inducir pequeñas inserciones o deleciones. Aquí, mostramos que algunos ARN de guía única (sgRNAs) pueden inducir la omisión de exones o grandes deleciones genómicas que eliminan los exones. Por ejemplo, La edición mediada por CRISPR del exón 3 de ?-catenina, que codifica un dominio auto inhibitorio, induce una omisión parcial del exón en el marco de lectura y la acumulación nuclear de la ?-catenina. Una sola guía única de ARN puede inducir pequeñas inserciones o deleciones que alteran parcialmente el proceso de corte y empalme o grandes deleciones inesperadas que remueven los exones. La omisión de exones se agrega a los resultados inesperados que deben ser contados, y quizás aprovechados, en los experimentos de CRISPR.

Abstract

CRISPR is widely used to disrupt gene function by inducing small insertions and deletions. Here, we show that some single-guide RNAs (sgRNAs) can induce exon skipping or large genomic deletions that delete exons. For example, CRISPR-mediated editing of ?-catenin exon 3, which encodes an autoinhibitory domain, induces partial skipping of the in-frame exon and nuclear accumulation of ?-catenin. A single sgRNA can induce small insertions or deletions that partially alter splicing or unexpected larger deletions that remove exons. Exon skipping adds to the unexpected outcomes that must be accounted for, and perhaps taken advantage of, in CRISPR experiments.

  

La conservación exige impulsores genéticos seguros

Título original: Conservation demands safe gene drive

Autores: Kevin M. Esvelt; Neil J. Gemmell

Revista: PLos biology

Año: 2017

Palabras clave: impulsores genéticos; control de plagas; bioseguridad; autopropagable

Resumen

El interés en desarrollar sistemas de impulsores genéticos para controlar especies invasoras está creciendo, con Nueva Zelanda considerando a la naciente tecnología como una forma de eliminar localmente las plagas de mamíferos que amenazan su flora y fauna únicas. Si los impulsores genéticos erradicaran con éxito estas poblaciones, muchos se alegrarían, pero ¿cuáles son las posibles consecuencias? Aquí, exploramos el riesgo de a propagación accidental que plantean las tecnologías de impulsores genéticos auto-propagables, destacamos los nuevos diseños de impulsores genéticos que podrían lograr mejores resultados, y explicamos por qué necesitamos discusiones abiertas e internacionales sobre una tecnología que podría tener ramificaciones globales.

Abstract

Interest in developing gene drive systems to control invasive species is growing, with New Zealand reportedly considering the nascent technology as a way to locally eliminate the mammalian pests that threaten its unique flora and fauna. If gene drives successfully eradicated these invasive populations, many would rejoice, but what are the possible consequences? Here, we explore the risk of accidental spread posed by self-propagating gene drive technologies, highlight new gene drive designs that might achieve better outcomes, and explain why we need open and international discussions concerning a technology that could have global ramifications.

Es probable que los Sistemas actuales de impulsores génicos CRISPR sean altamente invasivos en poblaciones salvajes

Título original: Current CRISPR gene drive systems are likely to be highly invasive in wild populations.

Autores: Charleston Noble; Ben Adlam; George M. Church; Kevin M. Esvelt; Martin A. Nowak

Revista: bioRxiv

Año: 2017

Palabras clave: impulsores genéticos; CRISPR; modelo matemático; factores atenuantes; variación genética permanente; tamaño de familia; poblaciones

Resumen

Reportes recientes han sugerido que es poco probable que los impulsores génicos basados en CRISPR invadan poblaciones silvestres debido a los alelos resistentes a impulsores que previenen su corte. Desarrollamos modelos matemáticos basados en datos empíricos para explicar este supuesto. Demostramos que aunque la resistencia evita que los sistemas de impulsores se propaguen a la fijación en grandes poblaciones, incluso los sistemas menos efectivos reportados hasta la fecha son altamente invasivos. Liberando un pequeño número de organismos usualmente causa invasión en poblaciones locales, seguidas por una invasión adicional de poblaciones conectadas por tasas de flujo genético muy bajas. Examinando los efectos de factores atenuantes, variación genética permanente, la endogamia y el tamaño de la familia, reveló que ninguno de estos evita la invasión en escenarios realistas. Se predijo que los sistemas de impulsores altamente efectivos serán aún más invasivos. Contrariamente al informe de las academias nacionales sobre impulsores génicos, nuestros resultados sugieren que los sistemas de impulsores génicos no deben desarrollarse ni probarse en el campo en las regiones que albergan el organismo huésped.

Abstract

Recent reports have suggested that CRISPR-based gene drives are unlikely to invade wild populations due to drive-resistant alleles that prevent cutting. Here we develop mathematical models based on existing empirical data to explicitly test this assumption. We show that although resistance prevents drive systems from spreading to fixation in large populations, even the least effective systems reported to date are highly invasive. Releasing a small number of organisms often causes invasion of the local population, followed by invasion of additional populations connected by very low gene flow rates. Examining the effects of mitigating factors including standing variation, inbreeding, and family size revealed that none of these prevent invasion in realistic scenarios. Highly effective drive systems are predicted to be even more invasive. Contrary to the National Academies report on gene drive, our results suggest that standard drive systems should not be developed nor field-tested in regions harboring the host organism.

  

¿Licencia para matar? Los programas de erradicación de enfermedades pueden no estar en línea con el Convenio sobre Diversidad Biológica.

Título original: License to Kill? Disease Eradication Programs May Not be in Line with the Convention on Biological Diversity.

Autores: Hochkirch A; Beninde J; Fischer M; Krahener A; Lindermann C; Matenaar D; Rohde K; Wagner N; Wesch C; Wirtz S; Zink A; Lötters S; Schmitt T; Proelss A; Veith M.

Revista: Conservation Letters

Año: 2017

Resumen

El crecimiento global de la población humana está asociado con muchos problemas, como la provisión de alimentos y agua, conflictos políticos, propagación de enfermedades y destrucción del medio ambiente. La mitigación de estos problemas se refleja en varias convenciones y programas globales, algunos de los cuales, sin embargo, son conflictivos. Aquí discutimos los conflictos entre la conservación de la biodiversidad y la erradicación de enfermedades. Numerosos programas de salud apuntan a erradicar patógenos, y muchos se centran en la erradicación de vectores, como los mosquitos u otros parásitos. Como estudio de caso, nos centramos en la campaña panafricana de erradicación del tse tsé y la tripanosomiasis , que tiene como objetivo erradicar un patógeno (Trypanosoma) así como su vector, el grupo entero de moscas tse tsé (Glossinidae). Como la distribución de las moscas coincide en gran medida con los puntos calientes de la biodiversidad de agua dulce en África, argüimos con una fuerte consideración de las cuestiones ambientales al aplicar medidas de control de vectores, especialmente las aplicaciones aéreas de insecticidas. Además, queremos estimular las discusiones sobre el valor de las especies ya sea la completa erradicación de un patógeno o vector está justificada en absoluto. Finalmente, hacemos un llamado a una mayor armonización de las convenciones internacionales. Se necesita evaluaciones de impacto ambiental adecuadas antes de que se lleven a cabo programas de control o erradicación para minimizar los efectos negativos sobre la biodiversidad

Abstract

Food and water provision, political con?icts, spread of diseases, and environ-mental destruction. The mitigation of these problems is mirrored in several global conventions and programs, some of which, however, are con?icting. Here, we discuss the con?icts between biodiversity conservation and disease eradication. Numerous health programs aim at eradicating pathogens, and many focus on the eradication of vectors, such as mosquitos or other parasites. As a case study, we focus on the Pan African Tsetse and Trypanosomiasis Eradication Campaign,  which aims at eradicating a pathogen (Trypanosoma) as well as its vector, the entire group of tsetse ?ies (Glossinidae). As the distri- bution of tsetse ?ies largely overlaps with the African hotspots of freshwater biodiversity, we argue for a strong consideration of environmental issues when applying vector control measures, especially the aerial applications of insecticides. Furthermore, we want to stimulate discussions on the value of species and whether full eradication of a pathogen or vector is justi?ed at all. Finally, we call for a stronger harmonization of international conventions. Proper en- vironmental impact assessments need to be conducted before control or eradication programs are carried out to minimize negative effects on biodiversity.

La expansión de la herramienta CRISPR

Título original: The expanding CRISPR toolbox

Autores: Josh Tycko; Gaelen T Hess; Edwin E Jeng; Michael Dubreuil & Michael C Bassik

Revista: Nature methods

Año: 2017

Palabras clave: efector proteico; CRISPR; nucleasa inactiva dCas9; expresión génetica; marcas epigenéticas

Resumen

El sistema de edición genómica CRISPR-Cas9 ha arrebatado el mundo de la ciencia biomédica. Inicialmente, los investigadores utilizaron nucleasa activa de CRISPR-Cas9 para eliminar o reemplazar genes a través de ediciones genéticas disruptivas o precisas. La herramienta CRISPR se expandió con el desarrollo de la nucleasa inactiva dCas9, la cual recluta a los efectores proteicos que modulan la expresión génica, a menudo escribiendo o removiendo marcas epigenéticas en el ADN y las histonas. Más reciente, los editores de base han aumentado la eficiencia de las sustituciones base dirigidas por CRISPR tanto para la edición precisa como para la diversificación de secuencias localizada. Esta herramienta en expansión ha permitido las manipulaciónes genéticas y epigenéticas específicas del sitio en una amplia gama de organismos.

Abstract

The CRISPR Cas9 genome-editing system has taken the world of biomedical science by storm. Initially, researchers used nuclease-active CRISPR Cas9 to knock out or replace genes through either disruptive or precise genome edits. The CRISPR toolbox expanded with the development of nuclease-inactive dCas9, which recruits protein effectors that modulate gene expression, often by writing or removing epigenetic marks on DNA and histones. Most recently, base editors have increased the efficiency of CRISPR-targeted base substitutions for both precision editing and localized sequence diversification. This expanding toolbox has enabled site-specific genetic and epigenetic manipulation in a wide array of organisms.

  

Caracterización molecular de rearreglos de plásmidos transformantes en arroz transgénico revela un sitio de alta recombinación (hotspot) en el promotor CaMV P35S y confirma la predominancia de la microhomología mediada por recombinación.

Título original: Molecular characterization of transforming plasmid rearrangements in transgenic rice reveals a recombination hotspot in the CaMV 35S promoter and confirms the predominance of microhomology mediated recombination

Autores: Kohli; A; Griffiths; S; Palacios; N; Twyman; R; Vain; P; Laurie; DA; Christou; P.

Revista: The Plant Journal

Año: 2002

Palabras clave: transformación; plásmidos; recombinación ilegítima; dicotiledóneas; CaMV35S; promotor 35S; p35S; plantas transgénicas; OGMs

Resumen

La caracterización de las uniones del ADN plasmídico y el genómico después de la transformación de plantas ha establecido vínculos entre la reparación de rotura de doble cadena del ADN (DSBR por sus siglas en inglés), la recombinación ilegítima y la integración del ADN plasmídico. La poca información sobre las uniones plásmido-plásmido en las plantas proviene de las especies dicotiledóneas de tabaco y Arabidopsis. Analizamos 12 líneas representativas de arroz transgénico, que contienen una serie de reordenamientos de plásmidos transformantes, que reflejaban predominantemente microhomologías mediadas por recombinación ilegítima involucrando fragmentos complementarios cortos en los extremos de recombinación. La ligación directa de extremos, en ausencia de homología entre las moléculas recombinantes, ocurrió solo raramente. Se encontró ADN de relleno en algunas de las uniones. Estaban presentes fragmentos cortos y ricos en purinas, ya sea en el sitio de la unión o en las regiones de flanqueo inmediatas. Los sitios de unión putativos de la ADN topoisomerasa I se agruparon alrededor de las uniones. Aunque hubo diferentes regiones del plásmido transformante involucradas en la recombinación plásmido-plásmido, demostramos que una secuencia palindrómica de 19 pb que incluye la caja TATA del promotor CaMV 35S, actuó como un punto de acceso para la recombinación. La mitad rica en purinas de la secuencia palindrómica estuvo específicamente involucrada en las uniones de recombinación. Este hotspot  de recombinación está ubicado dentro de la región "altamente recombinogénica" de la secuencia completa del ARN de CaMV que se ha demostrado que promueve la recombinación viral en plantas dicotiledóneas. La agrupación de eventos de recombinación de plásmidos en esta región altamente recombinogénica, incluso en ausencia de enzimas víricas y otros elementos que actúan en cis, demuestra que la maquinaria celular de la planta sola es suficiente para reconocer y actuar sobre estas secuencias virales. Nuestros datos también muestran la similitud entre los mecanismos que subyacen a la formación de uniones en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas transformadas utilizando diferentes procedimientos.

Abstract

The characterization of plasmid?genomic DNA junctions following plant transformation has established links between DNA double?strand break repair (DSBR), illegitimate recombination and plasmid DNA integration. The limited information on plasmid plasmid junctions in plants comes from the dicot species tobacco and Arabidopsis. We analyzed 12 representative transgenic rice lines, carrying a range of transforming plasmid rearrangements, which predominantly reflected microhomology mediated illegitimate recombination involving short complementary patches at the recombining ends. Direct end?ligation, in the absence of homology between the recombining molecules, occurred only rarely. Filler DNA was found at some of the junctions. Short, purine?rich tracts were present, either at the junction site or in the immediate flanking regions. Putative DNA topoisomerase I binding sites were clustered around the junctions. Although different regions of the transforming plasmid were involved in plasmid plasmid recombination, we showed that a 19 bp palindromic sequence, including the TATA box of the CaMV 35S promoter, acted as a recombination hotspot. The purine?rich half of the palindromic sequence was specifically involved at the recombination junctions. This recombination hotspot is located within the highly recombinogenic  region of the full?length CaMV RNA that has been shown to promote viral recombination in dicot plants. Clustering of plasmid recombination events in this highly recombinogenic region, even in the absence of viral enzymes and other cis?acting elements proves that the plant cellular machinery alone is sufficient to recognize and act on these viral sequences. Our data also show the similarity between mechanisms underlying junction formation in dicot and monocot plants transformed using different procedures.

Riesgos de plantas transgénicas que contienen el promotor del virus del mosaico de la coliflor.

Título original: Hazards of transgenic plants containing the cauliflower mosaic viral promoter.

Autores: Ho M; Ryan A; Cummins J.

Revista: Microbial Ecology in Health and Disease

Año: 2000

Palabras clave: inestabilidad genética; recombinación; transgénicos; CaMV35S; promotor 35S; p35S; plantas transgénicas; OGMs

Resumen

Esta es la carta respuesta a las críticas recibidas por una publicación anterior en donde se abordan los riesgos de utilizar un promotor viral en plantas transgénicas. A modo de resumen, ahí se señala que el promotor CaMV 35S tiene una función promiscua y funciona de manera eficiente en todas las plantas, así como en las algas verdes, levaduras y en E. coli. Tiene una estructura modular, con partes comunes e intercambiables con promotores de otros virus de plantas y animales. También tiene un hotspot  de recombinación, flanqueado por múltiples motivos involucrados en la recombinación, y es similar a otros, incluidos los bordes del vector de ADN-T de Agrobacterium que se usa con mucha frecuencia en la fabricación de plantas transgénicas. El posible mecanismo de recombinación (reparación de la rotura de ADN de doble cadena) requiere poca o ninguna homología de secuencia de ADN. Finalmente, la recombinación entre transgenes virales y virus infectantes se ha demostrado en el laboratorio. Se sabe que las construcciones transgénicas son inestables, y la existencia de un hotspot de recombinación exacerbará el problema. En consecuencia, las construcciones transgénicas que contienen el promotor CaMV pueden ser más propensas a la transferencia y recombinación de genes horizontales que el ADN no transgénico. Los peligros potenciales incluyen el reordenamiento del genoma, la mutagénesis por inserción, la carcinogénesis por inserción, la reactivación de virus latentes y la generación de nuevos virus. Estas consideraciones son especialmente relevantes a la luz de los hallazgos recientes de que ciertas papas transgénicas, que contienen el promotor CaMV 35S y se transforman con el vector ADN-T de Agrobacterium, pueden ser peligrosas para ratas jóvenes, y que una parte significativa de los efectos puede deberse a la construcción o a la transformación genética (o a ambas) . En consecuencia, pedimos que todos los cultivos y productos transgénicos que contienen el promotor CaMV se retiren y se prohíban, lo que está de acuerdo con el principio precautorio y con la ciencia sólida.

Abstract

As Rautenberg (1) rightly points out, our paper (2) was not drawn from research work that we have done ourselves, rather it was written to review and synthesize the scientific literature on and around the CaMV 35S promoter. This is a legitimate and important part of scientific activity, as science does not consist of isolated facts which bear no relationship to one another. It is precisely the web of mutual interrelationships of the findings that constitute science. More importantly, this maps out the universe of possibilities both for further research and for predicting potential hazards in risk assessment. Our critics disagree with the implications we draw from the scientific findings, and especially with our conclusions and recommendation. To recapitulate, we pointed out that the CaMV 35S promoter is promiscuous in function, and works efficiently in all plants, as well as green algae, yeast and E. coli. It has a modular structure, with parts common to, and interchangeable with promoters of other plant and animal viruses. It also has a recombination hotspot, flanked by multiple motifs involved in recombination, and is similar to other recombination hotspots including the borders of the Agrobacterium T DNA vector most frequently used in making transgenic plants. The suspected mechanism of recombination - double-stranded DNA break-repair - requires little or no DNA sequence homologies. Finally, recombination between viral transgenes and infecting viruses has been demonstrated in the laboratory. Transgenic constructs are already well-known to be unstable, and the existence of a recombination hotspot will exacerbate the problem. Consequently, transgenic constructs containing the CaMV promoter may be more prone to horizontal gene transfer and recombination than nontransgenic DNA. The potential hazards include genome rearrangement, insertion mutagenesis, insertion carcinogenesis, the reactivation of dormant viruses and generation of new viruses (reviewed in refs. 3 and 4). These considerations are especially relevant in the light of recent findings that certain transgenic potatoes - containing the CaMV 35S promoter and transformed with Agrobacterium T-DNA - may be unsafe for young rats, and that a significant part of the effects may be due to "the construct or the genetic transformation (or both)" (5). Consequently, we called for all transgenic crops and products containing the CaMV promoter to be withdrawn and banned, which is in accordance with the precautionary principle as well as sound science.

  

¿Es riesgoso el promotor CaMV

Título original: Hazardous CaMV promoter?

Autores: Ho M; Ryan A; Cummins J.

Revista: Nature Biotechnology

Año: 2000

Palabras clave: inestabilidad genética; recombinación; transgénicos; CaMV35S; promotor 35S; p35S; plantas transgénicas; OGMs

Resumen

Carta al Editor. Nuestro manuscrito analiza y sintetiza la literatura científica sobre el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que se utiliza para producir una sobreexpresión constitutiva de transgenes prácticamente en todos los cultivos GM ya comercializados o en pruebas de campo. El promotor funciona eficientemente en todas las plantas, las algas verdes, las levaduras y Escherichia coli. Tiene una estructura modular, con partes comunes e intercambiables con promotores de otros virus de plantas y animales. También tiene un hotspot de recombinación flanqueado por múltiples motivos implicados en la recombinación, similar a otros puntos que incluyen los bordes del vector de ADN-T de Agrobacterium que se utiliza con mayor frecuencia en la fabricación de plantas transgénicas. El supuesto mecanismo de recombinación (reparación de rotura de ADN de doble cadena) requiere poca o ninguna homología de secuencia de ADN, y se ha demostrado la combinación de transgenes virales y virus infecciosos en el laboratorio.

Abstract

Letter to the editor. Our manuscript analyzes and synthesizes the scientific literature on the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV), which is used to produce a constitutive overexpression of transgenes practically in all GM crops already marketed or in field trials. The promoter works efficiently in all plants, green algae, yeasts and Escherichia coli. It has a modular structure, with common and interchangeable parts with promoters of other plant and animal viruses. It also has a recombination hotspot flanked by multiple motifs involved in recombination, similar to other sites that include the edges of the Agrobacterium T-DNA vector that is most frequently used in the manufacture of transgenic plants. The putative recombination mechanism (repair of double-stranded DNA breakage) requires little or no DNA sequence homology, and the combination of viral transgenes and infectious viruses in the laboratory has been demonstrated.

Más allá de los límites: las trampas de los impulsores genéticos globales para la evaluación de riesgos ambientales en la Unión Europea

Título original: Beyond limits – the pitfalls of global gene drives for environmental risk assessment in the European Union

Autores: Marion Dolezel, Christoph Lüthi, Helmut Gaugitsch

Revista: BioRisk

Año: 2020

Palabras clave: Evaluación de riesgos ambientales, Unión Europea, impulsores genéticos, organismos modificados genéticamente.

Resumen

Se han sugerido que los organismos modificados por impulsores genéticos (GDO, por sus siglas en inglés) pueden enfocarse para combatir algunas de las cuestiones ambientales y de salud pública. Hasta este momento no se han liberado tales organismos en el medio ambiente, pero todavía no queda claro si las disposiciones reglamentarias pertinentes serán adecuadas para cubrir sus posibles riesgos ambientales, para la salud humana y animal si las liberaciones al ambiente de GDO son permitidas. Aquí, se evalúan las características novedosas de los GDO y se resaltan los desafíos resultantes para la evaluación de riesgos ambientales. Estos están relacionados con la definición del medio receptor, el uso del enfoque comparativo, la definición de daño potencial, el enfoque de pruebas escalonadas, la evaluación de riesgos a largo plazo y a gran escala a nivel de población y ecosistema y el seguimiento posterior a la liberación de los efectos adversos. Son necesarias adaptaciones fundamentales, así como el desarrollo de metodologías adecuadas de evaluación de riesgos para permitir una evaluación de riesgo operacional para GDO de expansión global antes de que estos organismos sean liberados al medio ambiente en la UE.

Abstract

Gene drive organisms (GDOs) have been suggested as approaches to combat some of the most pressing environmental and public health issues. No such organisms have so far been released into the environment, but it remains unclear whether the relevant regulatory provisions will be fit for purpose to cover their potential environmental, human and animal health risks if environmental releases of GDOs are envisaged. We evaluate the novel features of GDOs and outline the resulting challenges for the environmental risk assessment. These are related to the definition of the receiving environment, the use of the comparative approach, the definition of potential harm, the stepwise testing approach, the assessment of long-term and large-scale risks at population and ecosystem level and the post-release monitoring of adverse effects. Fundamental adaptations as well as the development of adequate risk assessment methodologies are needed in order to enable an operational risk assessment for globally spreading GDOs before these organisms are released into environments in the EU.

  

La ética de la ingeniería genética y de los impulsores genéticos en la conservación

Título original: The ethics of genetic engineering and gene drives in conservation

Autores: Ronald Sandler

Revista: Conservation Biology

Año: 2019

Palabras clave: Biología sintética, desarrollo responsable, filosofía de la conservación, evaluación de la tecnología, modificación genética, temas éticos.

Resumen

Los temas éticos asociados con el uso de la ingeniería genética y de los impulsores genéticos en la conservación están típicamente descritos en la evaluación y manejo de riesgos, la participación y aceptación pública, costos de oportunidad, distribuciones de riesgos y beneficios, y omisiones. Todo lo anterior es importante, pero las preocupaciones éticas se extienden más allá de los temas previos porque el uso de la ingeniería genética tiene el potencial de alterar significativamente las prácticas, conceptos y compromisos de valor de la conservación.

Busqué elucidar los temas éticos conectados con un enfoque potencial hacia la ingeniería genética en la conservación, y también proporcionar una estrategia para el análisis ético de las tecnologías novedosas para la conservación. Las razones principales ofrecidas como apoyo para el uso de la ingeniería genética y la transmisión de genes en la conservación son la eficacia y la necesidad de lograr los objetivos de conservación. La perspectiva ética instrumentalista asociada con estas razones involucra la evaluación de las tecnologías novedosas como medio para obtener los fines deseados. Para las poderosas tecnologías emergentes, la perspectiva instrumentalista necesita estar complementada con una perspectiva de forma de vida, la cual se aplica frecuentemente en la filosofía de la tecnología. La perspectiva de forma de vida involucra la consideración de cómo las tecnologías novedosas reestructuran las actividades a las cuales son introducidas. Cuando en la conservación se aplica la perspectiva de forma de vida a la ingeniería genética creativa, trae hacia el foco un conjunto de temas éticos, como aquellos asociados con el poder, el significado, las relaciones y los valores, que no captura la perspectiva instrumentalista. Esta perspectiva también ilustra sobre el por qué el uso de impulsores genéticos en la conservación es tan interesante ética y filosóficamente.

Abstract

The ethical issues associated with using genetic engineering and gene drives in conservation are typically described as consisting of risk assessment and management, public engagement and acceptance, opportunity costs, risk and benefit distributions, and oversight. These are important, but the ethical concerns extend beyond them because the use of genetic engineering has the potential to significantly alter the practices, concepts, and value commitments of conservation. I sought to elucidate the broader set of ethical issues connected with a potential genetic engineering turn in conservation and provide an approach to ethical analysis of novel conservation technologies. The primary rationales offered in support of using genetic engineering and gene drives in conservation are efficiency and necessity for achieving conservation goals. The instrumentalist ethical perspective associated with these rationales involves assessing novel technologies as a means to accomplish desired ends. For powerful emerging technologies the instrumentalist perspective needs to be complemented by a form-of-life perspective frequently applied in the philosophy of technology. The form-of-life perspective involves considering how novel technologies restructure the activities into which they are introduced. When the form-of-life perspective is applied to creative genetic engineering in conservation, it brings into focus a set of ethical issues, such as those associated with power, meaning, relationships, and values, that are not captured by the instrumentalist perspective. It also illuminates why the use of gene drives in conservation is so ethically and philosophically interesting. 

 

Evitar los efectos no blanco del sistema CRISPR / Cas9 sigue siendo un desafío para la transformación genética

Título original: Avoiding the off-target effects of CRISPR/cas9 system is still a challenging accomplishment for genetic transformation

Autores: Roberto Herai

Revista: Gene

Año: 2019

Palabras clave: Sistema CRISPR / cas9 Efectos fuera del objetivo Transformación genética.

Resumen

La reciente divulgación de que un embrión humano fue sometido a una transformación genética utilizando el sistema CRISPR / cas9 dio lugar a varias preocupaciones sobre cuestiones éticas sobre su uso incontrolado en humanos. Aunque CRISPR / cas9 ha demostrado su eficacia, este sistema todavía carece de la capacidad para evitar la introducción de mutaciones no deseadas a través del genoma diana. En este escrito presentamos varios de los impactos indeseables que el sistema CRISPR / Cas9 tiene en la modificación genética del genoma humano. Se discuten brevemente, utilizando la literatura recientemente publicada en distintas revistas de alto impacto, las principales preocupaciones relacionadas con CRISPR / Cas9 frente a sus efectos no deseados y cómo lo ha abordado la comunidad científica.

Abstract

The recent disclosure of a human embryo subjected to a genetic transformation using the CRISPR/cas9 system give rise to several concerns on ethical questions about its uncontrolled use in humans. Although CRISPR/cas9 has demonstrated its efficiency, this system still lacks the capability to avoid the introduction of undesirable mutations through the target genome. In this Letter, we present several undesirable impacts that CRISPR/cas9 system have in the genetic transformation of the human genome. We briefly discuss, using the very recent literature from distinct high impact journals, the main concerns related to CRISPR/cas9 to deal with off-target effects and how the research community has treated it.

  

Impulsores genéticos dependiente del umbral en la naturaleza: propagación, controlabilidad e Incertidumbre ecológica

Título original: Threshold-dependent gene drives in the wild: spread, controllability, and ecological uncertainty

Autores: Gregory A. Backus And Jason A. Delborne

Revista: Bioscience

Año: 2019

Palabras clave: Sistema CRISPR / Cas9; Efectos no deseados; Transformación genética.

Resumen

La tecnología de impulsores genéticos (gene drives) podría permitir la propagación intencional de un gen deseado a través de una población silvestre entera en relativamente pocas generaciones. Sin embargo, existe una gran preocupación de que los impulsores genéticos no se propaguen o se propaguen sin restricciones más allá de la población objetivo. La solución potencial es utilizar unidades dependientes del umbral más localizadas, que solo se propagan cuando se liberan en una población por encima de un nivel crítico. frecuencia. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, pequeños cambios en la aptitud del impulsor genético podrían conducir a resultados divergentes en el comportamiento de propagación. Ante la incertidumbre ecológica, la incapacidad de estimar la aptitud de los impulsos genéticos en el contexto fuera de laboratorio podría resultar problemática porque los impulsores genéticos diseñados para ser localizados podrían propagarse y fijarse en poblaciones vecinas si las condiciones ecológicas favorecen inesperadamente al impulsor genético. Esta perspectiva ofrece orientación a los desarrolladores y administradores porque sortear la diseminación y la capacidad de control del impulso genético podría ser arriesgado sin conocimiento detallado de los contextos ecológicos.

Abstract

Gene drive technology could allow the intentional spread of a desired gene throughout an entire wild population in relatively few generations. However, there are major concerns that gene drives could either fail to spread or spread without restraint beyond the targeted population. One potential solution is to use more localized threshold-dependent drives, which only spread when they are released in a population above a critical frequency. However, under certain conditions, small changes in gene drive fitness could lead to divergent outcomes in spreading behavior. In the face of ecological uncertainty, the inability to estimate gene drive fitness in a real-world context could prove problematic because gene drives designed to be localized could spread to fixation in neighboring populations if ecological conditions unexpectedly favor the gene drive. This perspective offers guidance to developers and managers because navigating gene drive spread and controllability could be risky without detailed knowledge of ecological contexts.

 

Los impulsores genéticos como una nueva cualidad en las liberaciones de OGM – una caracterización tecnológica comparativa

Título original: Gene drives as a new quality in GMO releases—a comparative technology characterization

Autores: Johannes L. Frieb, Arnim von Gleich y Bernd Gies

Revista: PeerJ 7:e6793

Año: 2019

Palabras clave: Ecología, genética, impulsores genéticos, biodiversidad, OGM.

Resumen

En comparación con las liberaciones anteriores de organismos genéticamente modificados (OGM) que eran principalmente plantas, los impulsores genéticos representan un cambio de paradigma en el manejo de OGM: la regulación actual de la liberación de OGM supone que durante períodos específicos de tiempo se liberará una cierta cantidad de OGM en una región en particular. Sin embargo, ahora surge un tipo de tecnología genética cuyo principio más íntimo reside en superar estos límites: la transformación o incluso la erradicación de poblaciones silvestres. El carácter invasivo de los impulsores genéticos exige un análisis exhaustivo de sus funcionalidades, fiabilidad e impacto potencial. Pero tales investigaciones se ven obstaculizadas por el hecho de que una prueba de campo experimental difícilmente sería reversible. Por lo tanto, una evaluación prospectiva adecuada es de suma importancia para una estimación del riesgo potencial asociado con la aplicación de impulsores genéticos. Este trabajo está destinado a respaldar la inevitable caracterización de los impulsores genéticos mediante un enfoque comparativo de evaluación de tecnología prospectiva con un enfoque en las posibles fuentes de riesgo. Allí, se abordan el peligro y el potencial de exposición, así como las incertidumbres con respecto al rendimiento de los impulsores genéticos sintéticos. Además, un análisis cuantitativo de su invasividad debería permitir una evaluación diferenciada de su poder para transformar poblaciones silvestres.

Abstract

Compared to previous releases of genetically modified organisms (GMOs) which were primarily plants, gene drives represent a paradigm shift in the handling of GMOs: Current regulation of the release of GMOs assumes that for specific periods of time a certain amount of GMOs will be released in a particular region. However, now a type of genetic technology arises whose innermost principle lies in exceeding these limits—the transformation or even eradication of wild populations. The invasive character of gene drives demands a thorough analysis of their functionalities, reliability and potential impact. But such investigations are hindered by the fact that an experimental field test would hardly be reversible. Therefore, an appropriate prospective assessment is of utmost importance for an estimation of the risk potential associated with the application of gene drives. This work is meant to support the inevitable characterization of gene drives by a comparative approach of prospective technology assessment with a focus on potential sources of risk. Therein, the hazard and exposure potential as well as uncertainties with regard to the performance of synthetic gene drives are addressed. Moreover, a quantitative analysis of their invasiveness should enable a differentiated evaluation of their power to transform wild populations.

  

Los impulsores genéticos y el régimen internacional de biodiversidad

Título original: Gene drives and the international biodiversity regime

Autores: Florian Rabitz

Revista: RECIEL 28:3 Special Issue: New Frontiers in Ocean Environmental Governance

Año: 2019

Palabras clave: Impulsores genéticos; Diversidad; Convenio de Diversidad Biológica; Protocolo de Cartagena; Regulación.

Resumen

Los impulsores genéticos son modificaciones genéticas diseñadas para difundir rápidamente rasgos en una población objetivo. Actualmente se proponen como agentes de control biológico para combatir, por ejemplo, las especies exóticas invasoras y los vectores de enfermedades transmisibles. También se plantean preocupaciones sobre sus posibles efectos adversos sobre la diversidad biológica. Este texto evalúa la gobernanza de los impulsores genéticos en el marco del Convenio sobre la Diversidad Biológica (CDB) y su Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad. Si bien los impulsores genéticos son directamente relevantes para los objetivos de ambos acuerdos, sus marcos regulatorios no han seguido el ritmo del cambio tecnológico. El enfoque de este artículo es el análisis de las lagunas e inconsistencias dentro de ambos acuerdos. Se destacan numerosos elementos del CDB y el Protocolo de Cartagena que plantean desafíos para la gobernanza de los impulsores genéticos, como cuestiones relacionadas con el alcance regulatorio, los movimientos transfronterizos, la precaución y las especies exóticas invasoras.

Abstract

Gene drives are genetic modifications designed for rapidly diffusing traits throughout a target population. They are currently being proposed as biological control agents to combat, for instance, invasive alien species and disease vectors. They also raise concerns regarding their potential adverse effects on biological diversity. This text assesses gene drive governance under the Convention on Biological Diversity (CBD) and its Cartagena Protocol on Biosafety. While gene drives are directly relevant for the objectives of both agreements, their regulatory frameworks have not kept up with the pace of technological change. The focus of this article is on the analysis of gaps and inconsistencies within both agreements. It highlights numerous elements of the CBD and the Cartagena Protocol that raise challenges for gene drive governance, such as matters related to regulatory scope, transboundary movements, precaution and invasive alien species.

 

La reparación de escisiones de doble hebra inducidas por CRISPR /Cas9 conduce a grandes eliminaciones y reordenamientos complejos

Título original: Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements

Autores: Michael Kosicki, Kärt Tomberg & Allan Bradley

Revista: Nature Biotechnology

Año: 2018

Palabras clave: Alteraciones genéticas inducidas, mutagénesis, daño genómico en células.

Resumen

CRISPR – Cas9 está posicionado para convertirse en la herramienta de edición genética de elección en contextos clínicos. Hasta ahora, la exploración de las alteraciones genéticas inducidas por Cas9se ha limitado a la inmediata proximidad del sitio blanco y a secuencias distales fuera del objetivo, lo que llevaba a la conclusión de que CRISPR – Cas9 era razonablemente específico. Aquí se informa sobre eventos de mutagénesis significativa en el sitio blanco, tales como eliminaciones grandes y reordenamientos genómicos más complejos en los sitios blanco en células madre embrionarias de ratón, progenitores hematopoyéticos de ratón y en una línea celular diferenciada humana. Usar la secuenciación de lecturas largas y genotipificación por PCR de amplio espectro, mostró que las rupturas de ADN mediadas Cas9 con ARN de guía única frecuentemente resultan en eliminaciones que se extienden más allá de muchas kilobases. Además, se identificaron lesiones distantes al sitio de corte y eventos cruzados. El daño genómico observado en células mitóticamente activas causado por la edición con CRISPR / Cas9 puede tener consecuencias patógenas.

Abstract

CRISPR–Cas9 is poised to become the gene editing tool of choice in clinical contexts. Thus far, exploration of Cas9-induced genetic alterations has been limited to the immediate vicinity of the target site and distal off-target sequences, leading to the conclusion that CRISPR–Cas9 was reasonably specific. Here we report significant on-target mutagenesis, such as large deletions and more complex genomic rearrangements at the targeted sites in mouse embryonic stem cells, mouse hematopoietic progenitors and a human differentiated cell line. Using long-read sequencing and long range PCR genotyping, we show that DNA breaks introduced by single-guide RNA/Cas9 frequently resolved into deletions extending over many kilobases. Furthermore, lesions distal to the cut site and crossover events were identified. The observed genomic damage in mitotically active cells caused by CRISPR–Cas9 editing may have pathogenic consequences.

  

CRISPR / Cas9 en insectos: aplicaciones, mejores prácticas y preocupaciones de bioseguridad

Título original: CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns

Autores: Clauvis Nji Tizi Taning, Benigna Van Eynde, Na Yu, Sanyuan Ma, Guy Smagghe

Revista: Journal of Insect Physiology

Año: 2017

Palabras clave: IInsectos y células de Insectos, función genética, ARN.

Resumen

Descubierto como un sistema inmunológico adaptativo bacteriano, CRISPR / Cas9 (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas) se está desarrollando como una atractiva herramienta de edición del genoma. Debido a su alta especificidad y aplicabilidad, la edición de genes mediada por CRISPR / Cas9 se ha empleado en una multitud de organismos y células, incluidos insectos, no solo para la investigación básica, como los estudios de función genética, sino también la investigación aplicada, como para la modificación de organismos de importancia económica. A pesar del rápido aumento en el uso de CRISPR en la edición del genoma de insectos, los resultados aún difieren de cada estudio, principalmente debido a diferencias existentes en los parámetros experimentales, como el Cas9 y la forma de ARN guía, el método de administración, el gen objetivo y los efectos en objetivos no blanco. Aquí, revisamos los informes actuales sobre el éxito de las aplicaciones de CRISPR / Cas9 en diversos insectos y células de insectos. Además de resumir varias de las mejores prácticas para generar una lista de verificación útil para el diseño de experimentos de CRISPR / Cas9 en insectos para principiantes. Por último, discutimos las preocupaciones de bioseguridad relacionadas con la liberación de insectos editados por CRISPR / Cas9 en el medio ambiente.

Abstract

Discovered as a bacterial adaptive immune system, CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR associated) is being developed as an attractive tool in genome editing. Due to its high specificity and applicability, CRISPR/Cas9-mediated gene editing has been employed in a multitude of organisms and cells, including insects, for not only fundamental research such as gene function studies, but also applied research such as modification of organisms of economic importance. Despite the rapid increase in the use of CRISPR in insect genome editing, results still differ from each study, principally due to existing differences in experimental parameters, such as the Cas9 and guide RNA form, the delivery method, the target gene and off-target effects. Here, we review current reports on the successes of CRISPR/Cas9 applications in diverse insects and insect cells. We furthermore summarize several best practices to give a useful checklist of CRISPR/Cas9 experimental setup in insects for beginners. Lastly, we discuss the biosafety concerns related to the release of CRISPR/Cas9-edited insects into the environment.

 

Impulsores genéticos en el horizonte: avanzar en la ciencia, navegar Incertidumbre y alineación de la investigación con los valores públicos

Título original: Gene drives on the horizon: advancing science, navigating uncertainty, and aligning research with public values

Autores: Comité de Investigación de Impulsores en Organismos No Humanos: Recomendaciones para la Conducta Responsable.

The National Academies Press

Año: 2016

Palabras clave: Impulsores Genéticos, conservación de especies amenazadas.

Resumen

La investigación en impulsores genéticos avanza rápidamente, y las aplicaciones propuestas probablemente continuarán ampliándose a medida que las herramientas de edición del genoma como CRISPR se vuelven más refinadas. Nueva información científica y perspectivas públicas surgen casi mensualmente acerca del uso y la aplicación de la investigación sobre impulsores genéticos. La naturaleza dinámica y rápidamente cambiante de este campo es alentadora y también motivo de preocupación. Los organismos modificados mediante impulsores genéticos prometen servir para abordar desafíos persistentes o problemas difíciles de resolver, como la erradicación de enfermedades transmitidas por vectores y la conservación de especies amenazadas y especies en peligro. Pero la presunta eficiencia de los organismos modificados mediante impulsores genéticos puede llevar a clamar por su liberación al ambiente en situaciones percibidas como críticas antes de que haya un conocimiento adecuado de sus efectos ecológicos, y antes de que se establezcan planes de mitigación para atender las consecuencias dañinas no deseadas asociadas. Se necesitará de evaluación y análisis continuo de las consideraciones de los aspectos sociales, ambientales, legales y éticos de los impulsores genéticos para desarrollar esta tecnología de manera responsable y adaptar la investigación y la gobernanza a los desafíos complejos y emergentes del campo.

Abstract

Gene drive research is advancing rapidly, and the proposed applications will likely continue to expand as genome editing tools such as CRISPR become more refined. New scientific information and public perspectives arise almost on a monthly basis concerning the use and application of gene drive research. The fast-moving nature of this field is both encouraging and a point of concern. Gene-drive modified organisms hold promise for addressing persistent or difficult-to-solve challenges, such as the eradication of vector-borne diseases and the conservation of threatened and endangered species. But the presumed efficiency of gene-drive modified organisms may lead to calls for their release in perceived crisis situations before there is adequate knowledge of ecological effects, and before mitigation plans for unintended harmful consequences are in place. Continuous evaluation and assessment of the social, environmental, legal, and ethical considerations of gene drives will be needed to develop this technology responsibly and adapt research and governance to the field’s complex and emerging challenges.

  

No hay tiempo que perder: los desafíos éticos creados por CRISPR

Título original: No time to waste—the ethical challenges created by CRISPR

Autores: Arthur L Caplan1, Brendan Parent1, Michael Shen2 & Carolyn Plunkett1,3

Revista: EMBO reports

Año: 2015

Palabras clave: Células de línea germinal humana, CRISPR, efectos no deseados, ética.

Resumen

Pese a ser una tecnología eficiente, sencilla y barata para editar el genoma de cualquier organismo, el sistema CRISPR / Cas, plantea muchos problemas éticos y regulatorios más allá del uso para manipular células de línea germinal humana.

Abstract

CRISPR/Cas, being an efficient, simple, and cheap technology to edit the genome of any organism, raises many ethical and regulatory issues beyond the use to manipulate human germ line cells.

 

Detección de modificaciones genómicas mediadas por CRISPR a través de patrones de metilación alterados en islas CpG

Título original: Detection of CRISPR-mediated genome modifications through altered methylation patterns of CpG islands

Autores: Farris, M.H., Texter, P.A., Mora, A.A. et al.

Revista: BMC Genomics 

Año: 2020

Palabras clave: Edición genómica por CRISPR, reparación dirigida por homología, unión de extremos no homólogos, modificación epigenética, islas CpG, varianza de metilación, detección de varianza estadística.

Resumen

El desarrollo y aplicación de tecnologías CRISPR para la modificación del genoma se están expandiendo con rapidez. Avances en este campo describen nuevos componentes CRISPR que son estratégicamente diseñados para mejorar la precisión y confiabilidad de la edición CRISPR dentro de la secuencia genómica. La modificación del genoma mediante rupturas del genoma que son dirigidas y mediadas por componentes CRISPR aprovechan mecanismos celulares para la reparación como la reparación directa por homología (HDR) para incorporar ediciones genómicas con mayor precisión. Resultados. En este informe, describimos la ganancia de metilación en ubicaciones de islas CpG típicamente hipometiladas (CGI) afectadas por la incorporación de ADN del donador mediada por CRISPR a través de mecanismos de reparación directa por homología. Con los patrones de metilación de las islas CpG utilizando la secuenciación completa del genoma utilizando bisulfito, estas interrupciones de metilación de CGI trazan la inserción de ADN del donante durante la edición genómica. Estas inserciones mediadas por recombinación dirigida por homología interrumpen el patrón de metilación generacional del CGI editado dentro de las células y su linaje celular dentro de la cepa animal, persistiendo a lo largo de generaciones. Nuestro enfoque describe un flujo de trabajo basado en estadística para indicar las ubicaciones de CGI modificados y proveen un mecanismo para evaluar la modificación directa del metiloma de CGI afectadas a nivel de CpG. Conclusiones. Con los avances en la tecnología de modificación del genoma surge la necesidad de detectar el nivel y la persistencia de los cambios en la metilación que las modificaciones de la secuencia genómica imponen sobre el metiloma editado colateralmente. Cualquier modificación del metiloma de células somáticas o de línea germinal, podrían tener implicaciones sobre los mecanismos de regulación génica gobernados por patrones de metilación de las regiones CGI en la aplicación de ediciones terapéuticas de regiones genómicas reguladas de forma más sensible. El método descrito localiza la modificación dirigida del epigenoma que persiste durante generaciones. Si bien esta observancia requiere observaciones moleculares de apoyo, como cambios directos en la secuencia o en la expresión genética, la observación de la modificación epigenética proporciona un indicador de que las ediciones genómicas intencionalmente dirigidas pueden conducir a cambios epigenómicos colaterales no intencionales posteriores a la modificación con persistencia generacional.

Abstract

The development and application of CRISPR technologies for the modification of the genome are rapidly expanding. Advances in the field describe new CRISPR components that are strategically engineered to improve the precision and reliability of CRISPR editing within the genome sequence. Genome modification using induced genome breaks that are targeted and mediated by CRISPR components leverage cellular mechanisms for repair like homology directed repair (HDR) to incorporate genomic edits with increased precision. In this report, we describe the gain of methylation at typically hypomethylated CpG island (CGI) locations affected by the CRISPR-mediated incorporation of donor DNA using HDR mechanisms. With characterization of CpG methylation patterns using whole genome bisulfite sequencing, these CGI methylation disruptions trace the insertion of the donor DNA during the genomic edit. These insertions mediated by homology-directed recombination disrupt the generational methylation pattern stability of the edited CGI within the cells and their cellular lineage within the animal strain, persisting across generations. Our approach describes a statistically based workflow for indicating locations of modified CGIs and provides a mechanism for evaluating the directed modification of the methylome of the affected CGI at the CpG-level. With advances in genome modification technology comes the need to detect the level and persistence of methylation change that modifications to the genomic sequence impose upon the collaterally edited methylome. Any modification of the methylome of somatic or germline cells could have implications for gene regulation mechanisms governed by the methylation patterns of CGI regions in the application of therapeutic edits of more sensitively regulated genomic regions. The method described here locates the directed modification of the mouse epigenome that persists over generations. While this observance would require supporting molecular observations such as direct sequence changes or gene expression changes, the observation of epigenetic modification provides an indicator that intentionally directed genomic edits can lead to collateral, unintentional epigenomic changes post modification with generational persistence.