1. Más allá de los límites: las trampas de los impulsores genéticos globales para la evaluación de riesgos ambientales en la Unión Europea

Título original: Beyond limits – the pitfalls of global gene drives for environmental risk assessment in the European Union

Autores: Marion Dolezel, Christoph Lüthi, Helmut Gaugitsch

Revista: BioRisk

Año: 2020

Palabras clave: Evaluación de riesgos ambientales, Unión Europea, impulsores genéticos, organismos modificados genéticamente.

Resumen

Se han sugerido que los organismos modificados por impulsores genéticos (GDO, por sus siglas en inglés) pueden enfocarse para combatir algunas de las cuestiones ambientales y de salud pública. Hasta este momento no se han liberado tales organismos en el medio ambiente, pero todavía no queda claro si las disposiciones reglamentarias pertinentes serán adecuadas para cubrir sus posibles riesgos ambientales, para la salud humana y animal si las liberaciones al ambiente de GDO son permitidas. Aquí, se evalúan las características novedosas de los GDO y se resaltan los desafíos resultantes para la evaluación de riesgos ambientales. Estos están relacionados con la definición del medio receptor, el uso del enfoque comparativo, la definición de daño potencial, el enfoque de pruebas escalonadas, la evaluación de riesgos a largo plazo y a gran escala a nivel de población y ecosistema y el seguimiento posterior a la liberación de los efectos adversos. Son necesarias adaptaciones fundamentales, así como el desarrollo de metodologías adecuadas de evaluación de riesgos para permitir una evaluación de riesgo operacional para GDO de expansión global antes de que estos organismos sean liberados al medio ambiente en la UE.

Abstract

Gene drive organisms (GDOs) have been suggested as approaches to combat some of the most pressing environmental and public health issues. No such organisms have so far been released into the environment, but it remains unclear whether the relevant regulatory provisions will be fit for purpose to cover their potential environmental, human and animal health risks if environmental releases of GDOs are envisaged. We evaluate the novel features of GDOs and outline the resulting challenges for the environmental risk assessment. These are related to the definition of the receiving environment, the use of the comparative approach, the definition of potential harm, the stepwise testing approach, the assessment of long-term and large-scale risks at population and ecosystem level and the post-release monitoring of adverse effects. Fundamental adaptations as well as the development of adequate risk assessment methodologies are needed in order to enable an operational risk assessment for globally spreading GDOs before these organisms are released into environments in the EU.

  

2. La ética de la ingeniería genética y de los impulsores genéticos en la conservación

Título original: The ethics of genetic engineering and gene drives in conservation

Autores: Ronald Sandler

Revista: Conservation Biology

Año: 2019

Palabras clave: Biología sintética, desarrollo responsable, filosofía de la conservación, evaluación de la tecnología, modificación genética, temas éticos.

Resumen

Los temas éticos asociados con el uso de la ingeniería genética y de los impulsores genéticos en la conservación están típicamente descritos en la evaluación y manejo de riesgos, la participación y aceptación pública, costos de oportunidad, distribuciones de riesgos y beneficios, y omisiones. Todo lo anterior es importante, pero las preocupaciones éticas se extienden más allá de los temas previos porque el uso de la ingeniería genética tiene el potencial de alterar significativamente las prácticas, conceptos y compromisos de valor de la conservación.

Busqué elucidar los temas éticos conectados con un enfoque potencial hacia la ingeniería genética en la conservación, y también proporcionar una estrategia para el análisis ético de las tecnologías novedosas para la conservación. Las razones principales ofrecidas como apoyo para el uso de la ingeniería genética y la transmisión de genes en la conservación son la eficacia y la necesidad de lograr los objetivos de conservación. La perspectiva ética instrumentalista asociada con estas razones involucra la evaluación de las tecnologías novedosas como medio para obtener los fines deseados. Para las poderosas tecnologías emergentes, la perspectiva instrumentalista necesita estar complementada con una perspectiva de forma de vida, la cual se aplica frecuentemente en la filosofía de la tecnología. La perspectiva de forma de vida involucra la consideración de cómo las tecnologías novedosas reestructuran las actividades a las cuales son introducidas. Cuando en la conservación se aplica la perspectiva de forma de vida a la ingeniería genética creativa, trae hacia el foco un conjunto de temas éticos, como aquellos asociados con el poder, el significado, las relaciones y los valores, que no captura la perspectiva instrumentalista. Esta perspectiva también ilustra sobre el por qué el uso de impulsores genéticos en la conservación es tan interesante ética y filosóficamente.

Abstract

The ethical issues associated with using genetic engineering and gene drives in conservation are typically described as consisting of risk assessment and management, public engagement and acceptance, opportunity costs, risk and benefit distributions, and oversight. These are important, but the ethical concerns extend beyond them because the use of genetic engineering has the potential to significantly alter the practices, concepts, and value commitments of conservation. I sought to elucidate the broader set of ethical issues connected with a potential genetic engineering turn in conservation and provide an approach to ethical analysis of novel conservation technologies. The primary rationales offered in support of using genetic engineering and gene drives in conservation are efficiency and necessity for achieving conservation goals. The instrumentalist ethical perspective associated with these rationales involves assessing novel technologies as a means to accomplish desired ends. For powerful emerging technologies the instrumentalist perspective needs to be complemented by a form-of-life perspective frequently applied in the philosophy of technology. The form-of-life perspective involves considering how novel technologies restructure the activities into which they are introduced. When the form-of-life perspective is applied to creative genetic engineering in conservation, it brings into focus a set of ethical issues, such as those associated with power, meaning, relationships, and values, that are not captured by the instrumentalist perspective. It also illuminates why the use of gene drives in conservation is so ethically and philosophically interesting. 

 

3. Evitar los efectos no blanco del sistema CRISPR / Cas9 sigue siendo un desafío para la transformación genética

Título original: Avoiding the off-target effects of CRISPR/cas9 system is still a challenging accomplishment for genetic transformation

Autores: Roberto Herai

Revista: Gene

Año: 2019

Palabras clave: Sistema CRISPR / cas9 Efectos fuera del objetivo Transformación genética.

Resumen

La reciente divulgación de que un embrión humano fue sometido a una transformación genética utilizando el sistema CRISPR / cas9 dio lugar a varias preocupaciones sobre cuestiones éticas sobre su uso incontrolado en humanos. Aunque CRISPR / cas9 ha demostrado su eficacia, este sistema todavía carece de la capacidad para evitar la introducción de mutaciones no deseadas a través del genoma diana. En este escrito presentamos varios de los impactos indeseables que el sistema CRISPR / Cas9 tiene en la modificación genética del genoma humano. Se discuten brevemente, utilizando la literatura recientemente publicada en distintas revistas de alto impacto, las principales preocupaciones relacionadas con CRISPR / Cas9 frente a sus efectos no deseados y cómo lo ha abordado la comunidad científica.

Abstract

The recent disclosure of a human embryo subjected to a genetic transformation using the CRISPR/cas9 system give rise to several concerns on ethical questions about its uncontrolled use in humans. Although CRISPR/cas9 has demonstrated its efficiency, this system still lacks the capability to avoid the introduction of undesirable mutations through the target genome. In this Letter, we present several undesirable impacts that CRISPR/cas9 system have in the genetic transformation of the human genome. We briefly discuss, using the very recent literature from distinct high impact journals, the main concerns related to CRISPR/cas9 to deal with off-target effects and how the research community has treated it.

  

4. Impulsores genéticos dependiente del umbral en la naturaleza: propagación, controlabilidad e Incertidumbre ecológica

Título original: Threshold-dependent gene drives in the wild: spread, controllability, and ecological uncertainty

Autores: Gregory A. Backus And Jason A. Delborne

Revista: Bioscience

Año: 2019

Palabras clave: Sistema CRISPR / Cas9; Efectos no deseados; Transformación genética.

Resumen

La tecnología de impulsores genéticos (gene drives) podría permitir la propagación intencional de un gen deseado a través de una población silvestre entera en relativamente pocas generaciones. Sin embargo, existe una gran preocupación de que los impulsores genéticos no se propaguen o se propaguen sin restricciones más allá de la población objetivo. La solución potencial es utilizar unidades dependientes del umbral más localizadas, que solo se propagan cuando se liberan en una población por encima de un nivel crítico. frecuencia. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, pequeños cambios en la aptitud del impulsor genético podrían conducir a resultados divergentes en el comportamiento de propagación. Ante la incertidumbre ecológica, la incapacidad de estimar la aptitud de los impulsos genéticos en el contexto fuera de laboratorio podría resultar problemática porque los impulsores genéticos diseñados para ser localizados podrían propagarse y fijarse en poblaciones vecinas si las condiciones ecológicas favorecen inesperadamente al impulsor genético. Esta perspectiva ofrece orientación a los desarrolladores y administradores porque sortear la diseminación y la capacidad de control del impulso genético podría ser arriesgado sin conocimiento detallado de los contextos ecológicos.

Abstract

Gene drive technology could allow the intentional spread of a desired gene throughout an entire wild population in relatively few generations. However, there are major concerns that gene drives could either fail to spread or spread without restraint beyond the targeted population. One potential solution is to use more localized threshold-dependent drives, which only spread when they are released in a population above a critical frequency. However, under certain conditions, small changes in gene drive fitness could lead to divergent outcomes in spreading behavior. In the face of ecological uncertainty, the inability to estimate gene drive fitness in a real-world context could prove problematic because gene drives designed to be localized could spread to fixation in neighboring populations if ecological conditions unexpectedly favor the gene drive. This perspective offers guidance to developers and managers because navigating gene drive spread and controllability could be risky without detailed knowledge of ecological contexts.

 

5. Los impulsores genéticos como una nueva cualidad en las liberaciones de OGM – una caracterización tecnológica comparativa

Título original: Gene drives as a new quality in GMO releases—a comparative technology characterization

Autores: Johannes L. Frieb, Arnim von Gleich y Bernd Gies

Revista: PeerJ 7:e6793

Año: 2019

Palabras clave: Ecología, genética, impulsores genéticos, biodiversidad, OGM.

Resumen

En comparación con las liberaciones anteriores de organismos genéticamente modificados (OGM) que eran principalmente plantas, los impulsores genéticos representan un cambio de paradigma en el manejo de OGM: la regulación actual de la liberación de OGM supone que durante períodos específicos de tiempo se liberará una cierta cantidad de OGM en una región en particular. Sin embargo, ahora surge un tipo de tecnología genética cuyo principio más íntimo reside en superar estos límites: la transformación o incluso la erradicación de poblaciones silvestres. El carácter invasivo de los impulsores genéticos exige un análisis exhaustivo de sus funcionalidades, fiabilidad e impacto potencial. Pero tales investigaciones se ven obstaculizadas por el hecho de que una prueba de campo experimental difícilmente sería reversible. Por lo tanto, una evaluación prospectiva adecuada es de suma importancia para una estimación del riesgo potencial asociado con la aplicación de impulsores genéticos. Este trabajo está destinado a respaldar la inevitable caracterización de los impulsores genéticos mediante un enfoque comparativo de evaluación de tecnología prospectiva con un enfoque en las posibles fuentes de riesgo. Allí, se abordan el peligro y el potencial de exposición, así como las incertidumbres con respecto al rendimiento de los impulsores genéticos sintéticos. Además, un análisis cuantitativo de su invasividad debería permitir una evaluación diferenciada de su poder para transformar poblaciones silvestres.

Abstract

Compared to previous releases of genetically modified organisms (GMOs) which were primarily plants, gene drives represent a paradigm shift in the handling of GMOs: Current regulation of the release of GMOs assumes that for specific periods of time a certain amount of GMOs will be released in a particular region. However, now a type of genetic technology arises whose innermost principle lies in exceeding these limits—the transformation or even eradication of wild populations. The invasive character of gene drives demands a thorough analysis of their functionalities, reliability and potential impact. But such investigations are hindered by the fact that an experimental field test would hardly be reversible. Therefore, an appropriate prospective assessment is of utmost importance for an estimation of the risk potential associated with the application of gene drives. This work is meant to support the inevitable characterization of gene drives by a comparative approach of prospective technology assessment with a focus on potential sources of risk. Therein, the hazard and exposure potential as well as uncertainties with regard to the performance of synthetic gene drives are addressed. Moreover, a quantitative analysis of their invasiveness should enable a differentiated evaluation of their power to transform wild populations.

  

6. Los impulsores genéticos y el régimen internacional de biodiversidad

Título original: Gene drives and the international biodiversity regime

Autores: Florian Rabitz

Revista: RECIEL 28:3 Special Issue: New Frontiers in Ocean Environmental Governance

Año: 2019

Palabras clave: Impulsores genéticos; Diversidad; Convenio de Diversidad Biológica; Protocolo de Cartagena; Regulación.

Resumen

Los impulsores genéticos son modificaciones genéticas diseñadas para difundir rápidamente rasgos en una población objetivo. Actualmente se proponen como agentes de control biológico para combatir, por ejemplo, las especies exóticas invasoras y los vectores de enfermedades transmisibles. También se plantean preocupaciones sobre sus posibles efectos adversos sobre la diversidad biológica. Este texto evalúa la gobernanza de los impulsores genéticos en el marco del Convenio sobre la Diversidad Biológica (CDB) y su Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad. Si bien los impulsores genéticos son directamente relevantes para los objetivos de ambos acuerdos, sus marcos regulatorios no han seguido el ritmo del cambio tecnológico. El enfoque de este artículo es el análisis de las lagunas e inconsistencias dentro de ambos acuerdos. Se destacan numerosos elementos del CDB y el Protocolo de Cartagena que plantean desafíos para la gobernanza de los impulsores genéticos, como cuestiones relacionadas con el alcance regulatorio, los movimientos transfronterizos, la precaución y las especies exóticas invasoras.

Abstract

Gene drives are genetic modifications designed for rapidly diffusing traits throughout a target population. They are currently being proposed as biological control agents to combat, for instance, invasive alien species and disease vectors. They also raise concerns regarding their potential adverse effects on biological diversity. This text assesses gene drive governance under the Convention on Biological Diversity (CBD) and its Cartagena Protocol on Biosafety. While gene drives are directly relevant for the objectives of both agreements, their regulatory frameworks have not kept up with the pace of technological change. The focus of this article is on the analysis of gaps and inconsistencies within both agreements. It highlights numerous elements of the CBD and the Cartagena Protocol that raise challenges for gene drive governance, such as matters related to regulatory scope, transboundary movements, precaution and invasive alien species.

 

7. La reparación de escisiones de doble hebra inducidas por CRISPR /Cas9 conduce a grandes eliminaciones y reordenamientos complejos

Título original: Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements

Autores: Michael Kosicki, Kärt Tomberg & Allan Bradley

Revista: Nature Biotechnology

Año: 2018

Palabras clave: Alteraciones genéticas inducidas, mutagénesis, daño genómico en células.

Resumen

CRISPR – Cas9 está posicionado para convertirse en la herramienta de edición genética de elección en contextos clínicos. Hasta ahora, la exploración de las alteraciones genéticas inducidas por Cas9se ha limitado a la inmediata proximidad del sitio blanco y a secuencias distales fuera del objetivo, lo que llevaba a la conclusión de que CRISPR – Cas9 era razonablemente específico. Aquí se informa sobre eventos de mutagénesis significativa en el sitio blanco, tales como eliminaciones grandes y reordenamientos genómicos más complejos en los sitios blanco en células madre embrionarias de ratón, progenitores hematopoyéticos de ratón y en una línea celular diferenciada humana. Usar la secuenciación de lecturas largas y genotipificación por PCR de amplio espectro, mostró que las rupturas de ADN mediadas Cas9 con ARN de guía única frecuentemente resultan en eliminaciones que se extienden más allá de muchas kilobases. Además, se identificaron lesiones distantes al sitio de corte y eventos cruzados. El daño genómico observado en células mitóticamente activas causado por la edición con CRISPR / Cas9 puede tener consecuencias patógenas.

Abstract

CRISPR–Cas9 is poised to become the gene editing tool of choice in clinical contexts. Thus far, exploration of Cas9-induced genetic alterations has been limited to the immediate vicinity of the target site and distal off-target sequences, leading to the conclusion that CRISPR–Cas9 was reasonably specific. Here we report significant on-target mutagenesis, such as large deletions and more complex genomic rearrangements at the targeted sites in mouse embryonic stem cells, mouse hematopoietic progenitors and a human differentiated cell line. Using long-read sequencing and long range PCR genotyping, we show that DNA breaks introduced by single-guide RNA/Cas9 frequently resolved into deletions extending over many kilobases. Furthermore, lesions distal to the cut site and crossover events were identified. The observed genomic damage in mitotically active cells caused by CRISPR–Cas9 editing may have pathogenic consequences.

  

8. CRISPR / Cas9 en insectos: aplicaciones, mejores prácticas y preocupaciones de bioseguridad

Título original: CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns

Autores: Clauvis Nji Tizi Taning, Benigna Van Eynde, Na Yu, Sanyuan Ma, Guy Smagghe

Revista: Journal of Insect Physiology

Año: 2017

Palabras clave: IInsectos y células de Insectos, función genética, ARN.

Resumen

Descubierto como un sistema inmunológico adaptativo bacteriano, CRISPR / Cas9 (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas) se está desarrollando como una atractiva herramienta de edición del genoma. Debido a su alta especificidad y aplicabilidad, la edición de genes mediada por CRISPR / Cas9 se ha empleado en una multitud de organismos y células, incluidos insectos, no solo para la investigación básica, como los estudios de función genética, sino también la investigación aplicada, como para la modificación de organismos de importancia económica. A pesar del rápido aumento en el uso de CRISPR en la edición del genoma de insectos, los resultados aún difieren de cada estudio, principalmente debido a diferencias existentes en los parámetros experimentales, como el Cas9 y la forma de ARN guía, el método de administración, el gen objetivo y los efectos en objetivos no blanco. Aquí, revisamos los informes actuales sobre el éxito de las aplicaciones de CRISPR / Cas9 en diversos insectos y células de insectos. Además de resumir varias de las mejores prácticas para generar una lista de verificación útil para el diseño de experimentos de CRISPR / Cas9 en insectos para principiantes. Por último, discutimos las preocupaciones de bioseguridad relacionadas con la liberación de insectos editados por CRISPR / Cas9 en el medio ambiente.

Abstract

Discovered as a bacterial adaptive immune system, CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR associated) is being developed as an attractive tool in genome editing. Due to its high specificity and applicability, CRISPR/Cas9-mediated gene editing has been employed in a multitude of organisms and cells, including insects, for not only fundamental research such as gene function studies, but also applied research such as modification of organisms of economic importance. Despite the rapid increase in the use of CRISPR in insect genome editing, results still differ from each study, principally due to existing differences in experimental parameters, such as the Cas9 and guide RNA form, the delivery method, the target gene and off-target effects. Here, we review current reports on the successes of CRISPR/Cas9 applications in diverse insects and insect cells. We furthermore summarize several best practices to give a useful checklist of CRISPR/Cas9 experimental setup in insects for beginners. Lastly, we discuss the biosafety concerns related to the release of CRISPR/Cas9-edited insects into the environment.

 

9. Impulsores genéticos en el horizonte: avanzar en la ciencia, navegar Incertidumbre y alineación de la investigación con los valores públicos

Título original: Gene drives on the horizon: advancing science, navigating uncertainty, and aligning research with public values

Autores: Comité de Investigación de Impulsores en Organismos No Humanos: Recomendaciones para la Conducta Responsable.

The National Academies Press

Año: 2016

Palabras clave: Impulsores Genéticos, conservación de especies amenazadas.

Resumen

La investigación en impulsores genéticos avanza rápidamente, y las aplicaciones propuestas probablemente continuarán ampliándose a medida que las herramientas de edición del genoma como CRISPR se vuelven más refinadas. Nueva información científica y perspectivas públicas surgen casi mensualmente acerca del uso y la aplicación de la investigación sobre impulsores genéticos. La naturaleza dinámica y rápidamente cambiante de este campo es alentadora y también motivo de preocupación. Los organismos modificados mediante impulsores genéticos prometen servir para abordar desafíos persistentes o problemas difíciles de resolver, como la erradicación de enfermedades transmitidas por vectores y la conservación de especies amenazadas y especies en peligro. Pero la presunta eficiencia de los organismos modificados mediante impulsores genéticos puede llevar a clamar por su liberación al ambiente en situaciones percibidas como críticas antes de que haya un conocimiento adecuado de sus efectos ecológicos, y antes de que se establezcan planes de mitigación para atender las consecuencias dañinas no deseadas asociadas. Se necesitará de evaluación y análisis continuo de las consideraciones de los aspectos sociales, ambientales, legales y éticos de los impulsores genéticos para desarrollar esta tecnología de manera responsable y adaptar la investigación y la gobernanza a los desafíos complejos y emergentes del campo.

Abstract

Gene drive research is advancing rapidly, and the proposed applications will likely continue to expand as genome editing tools such as CRISPR become more refined. New scientific information and public perspectives arise almost on a monthly basis concerning the use and application of gene drive research. The fast-moving nature of this field is both encouraging and a point of concern. Gene-drive modified organisms hold promise for addressing persistent or difficult-to-solve challenges, such as the eradication of vector-borne diseases and the conservation of threatened and endangered species. But the presumed efficiency of gene-drive modified organisms may lead to calls for their release in perceived crisis situations before there is adequate knowledge of ecological effects, and before mitigation plans for unintended harmful consequences are in place. Continuous evaluation and assessment of the social, environmental, legal, and ethical considerations of gene drives will be needed to develop this technology responsibly and adapt research and governance to the field’s complex and emerging challenges.

  

10. No hay tiempo que perder: los desafíos éticos creados por CRISPR

Título original: No time to waste—the ethical challenges created by CRISPR

Autores: Arthur L Caplan1, Brendan Parent1, Michael Shen2 & Carolyn Plunkett1,3

Revista: EMBO reports

Año: 2015

Palabras clave: Células de línea germinal humana, CRISPR, efectos no deseados, ética.

Resumen

Pese a ser una tecnología eficiente, sencilla y barata para editar el genoma de cualquier organismo, el sistema CRISPR / Cas, plantea muchos problemas éticos y regulatorios más allá del uso para manipular células de línea germinal humana.

Abstract

CRISPR/Cas, being an efficient, simple, and cheap technology to edit the genome of any organism, raises many ethical and regulatory issues beyond the use to manipulate human germ line cells.

 

11. Detección de modificaciones genómicas mediadas por CRISPR a través de patrones de metilación alterados en islas CpG

Título original: Detection of CRISPR-mediated genome modifications through altered methylation patterns of CpG islands

Autores: Farris, M.H., Texter, P.A., Mora, A.A. et al.

Revista: BMC Genomics 

Año: 2020

Palabras clave: Edición genómica por CRISPR, reparación dirigida por homología, unión de extremos no homólogos, modificación epigenética, islas CpG, varianza de metilación, detección de varianza estadística.

Resumen

El desarrollo y aplicación de tecnologías CRISPR para la modificación del genoma se están expandiendo con rapidez. Avances en este campo describen nuevos componentes CRISPR que son estratégicamente diseñados para mejorar la precisión y confiabilidad de la edición CRISPR dentro de la secuencia genómica. La modificación del genoma mediante rupturas del genoma que son dirigidas y mediadas por componentes CRISPR aprovechan mecanismos celulares para la reparación como la reparación directa por homología (HDR) para incorporar ediciones genómicas con mayor precisión. Resultados. En este informe, describimos la ganancia de metilación en ubicaciones de islas CpG típicamente hipometiladas (CGI) afectadas por la incorporación de ADN del donador mediada por CRISPR a través de mecanismos de reparación directa por homología. Con los patrones de metilación de las islas CpG utilizando la secuenciación completa del genoma utilizando bisulfito, estas interrupciones de metilación de CGI trazan la inserción de ADN del donante durante la edición genómica. Estas inserciones mediadas por recombinación dirigida por homología interrumpen el patrón de metilación generacional del CGI editado dentro de las células y su linaje celular dentro de la cepa animal, persistiendo a lo largo de generaciones. Nuestro enfoque describe un flujo de trabajo basado en estadística para indicar las ubicaciones de CGI modificados y proveen un mecanismo para evaluar la modificación directa del metiloma de CGI afectadas a nivel de CpG. Conclusiones. Con los avances en la tecnología de modificación del genoma surge la necesidad de detectar el nivel y la persistencia de los cambios en la metilación que las modificaciones de la secuencia genómica imponen sobre el metiloma editado colateralmente. Cualquier modificación del metiloma de células somáticas o de línea germinal, podrían tener implicaciones sobre los mecanismos de regulación génica gobernados por patrones de metilación de las regiones CGI en la aplicación de ediciones terapéuticas de regiones genómicas reguladas de forma más sensible. El método descrito localiza la modificación dirigida del epigenoma que persiste durante generaciones. Si bien esta observancia requiere observaciones moleculares de apoyo, como cambios directos en la secuencia o en la expresión genética, la observación de la modificación epigenética proporciona un indicador de que las ediciones genómicas intencionalmente dirigidas pueden conducir a cambios epigenómicos colaterales no intencionales posteriores a la modificación con persistencia generacional.

Abstract

The development and application of CRISPR technologies for the modification of the genome are rapidly expanding. Advances in the field describe new CRISPR components that are strategically engineered to improve the precision and reliability of CRISPR editing within the genome sequence. Genome modification using induced genome breaks that are targeted and mediated by CRISPR components leverage cellular mechanisms for repair like homology directed repair (HDR) to incorporate genomic edits with increased precision. In this report, we describe the gain of methylation at typically hypomethylated CpG island (CGI) locations affected by the CRISPR-mediated incorporation of donor DNA using HDR mechanisms. With characterization of CpG methylation patterns using whole genome bisulfite sequencing, these CGI methylation disruptions trace the insertion of the donor DNA during the genomic edit. These insertions mediated by homology-directed recombination disrupt the generational methylation pattern stability of the edited CGI within the cells and their cellular lineage within the animal strain, persisting across generations. Our approach describes a statistically based workflow for indicating locations of modified CGIs and provides a mechanism for evaluating the directed modification of the methylome of the affected CGI at the CpG-level. With advances in genome modification technology comes the need to detect the level and persistence of methylation change that modifications to the genomic sequence impose upon the collaterally edited methylome. Any modification of the methylome of somatic or germline cells could have implications for gene regulation mechanisms governed by the methylation patterns of CGI regions in the application of therapeutic edits of more sensitively regulated genomic regions. The method described here locates the directed modification of the mouse epigenome that persists over generations. While this observance would require supporting molecular observations such as direct sequence changes or gene expression changes, the observation of epigenetic modification provides an indicator that intentionally directed genomic edits can lead to collateral, unintentional epigenomic changes post modification with generational persistence.